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目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原(PSCA)真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。 相似文献
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目的:通过构建及鉴定miR-200a的真核表达载体pcDNA3.1(+)-miR-200a,为进一步研究miR-200a的功能奠定实验基础。方法:RT-PCR扩增pre—miR-200a基因序列,连接于表达载体pcDNA3.1(+)中,对重组质粒双酶切鉴定并测序验证。结果:pcDNA3.1(+)-miR-200a真核表达载体经酶切及测序鉴定正确。结论:pcDNA3.1(+)-miR-200a真核表达载体构建成功,为下一步深入研究miR-200a的生物学功能和验证miR-200a的靶基因提供有效工具。 相似文献
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目的构建人G250真核表达载体,建立稳定表达人G250的小鼠黑色素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人G250基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo-sig中,并加入酶切位点和FLAG标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-sig-FLAG-G250。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR及免疫荧光检测人G250在B16细胞中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-sig-FLAG-G250重组质粒构建正确,最终建立的表达人G250基因的B16细胞系阳性率接近100%。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-sig-FLAG-G250,建立的稳定转染人G250小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达G250基因。该稳定转染细胞系的建立为G250在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。 相似文献
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目的对人miR-34a(hsa-miR-34a)下游靶基因进行预测,并构建含自噬相关基因靶结合序列的GFP报告基因载体。方法使用TargetScan Release 5.1和RNA22软件分析hsa-miR-34a可能的靶基因,并利用Gominer软件对靶基因功能进行分析。根据预测结果,合成含自噬相关基因hsa-miR-34a靶序列的寡核苷酸,以pEGFPC2为载体构建系列质粒,并检测各载体的真核表达情况。结果预测结果显示hsa-miR-34a共有2904个下游靶基因,功能涵盖生物过程、细胞组分、分子功能三大类,其中与自噬作用直接相关的靶基因有beclin 1和sestrin 2。构建含beclin 1和sestrin 2作用位点的GFP载体共5个,质粒转染Hela细胞后在荧光显微镜下可见绿色荧光。结论成功构建hsa-miR-34a下游自噬相关基因靶位点序列GFP报告基因载体,为进一步研究hsa-miR-34a对自噬的调控作用奠定基础。 相似文献
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目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。 相似文献
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ILLLI对银屑病患者外周血CD4+T细胞Fas蛋白表达的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:探索ILLLI治疗对银屑病患者外周血CD4+T细胞Fas蛋白表达的影响。方法:取患者及正常对照组静脉血10ml,肝素抗凝,等份分别加入4支试管中,1支为未照射组,3支照射组分为30、60和120分钟,以输出功率5mW的氦氖激光照射,并进行荧光染色和流式细胞分析。结果:照射前银屑病组表达Fas蛋白的CD4+T细胞百分比为21.4±3.1%,较正常对照组的16.8±2.1%显著增加,差异有显著性,p<0.05。正常对照组在激光照射30分钟、60分钟和120分钟,表达Fas蛋白的CD4+T细胞百分比分别为18.0±5.3%、16.4±5.2%和19.8±6.7%,与照射前差异无显著性,p>0.05;而患者组在激光照射30分钟、60分钟和120分钟时,表达Fas蛋白的CD4+T细胞百分比分别为24.3±2.8%、28.3±5.3%和30.5±7.9%,可以看出,随着照射时间的延长,表达Fas蛋白的CD4+T细胞的数量不断增加,60分钟和120分钟,表达Fas蛋白的CD4+T细胞百分比较照射前增加显著,有统计学差异,p<0.05。结论:银屑病的发病机制可能与细胞凋亡失控等多种因素有关。激光治疗银屑病的机制可能与它下调IL—8水平、上调TNF—(表达、纠正患者的凋亡失控状态有关。 相似文献
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目的研究Bax基因在稳定和不稳定粥样斑块中的表达及临床意义。方法颈动脉内膜剥脱术标本25例,由病理学分成稳定性(14例)和不稳定性(11例)两组,对照组正常动脉取自肝移植供者的腹主动脉及其分支(6例);进行免疫组化,原位杂交和原位凋亡DNA缺口末端标记法(TUNEL)测定Bax凋亡基因表达。结果稳定性斑块Bax阳性表达免疫组化5例,原位杂交5例,TUNEL阳性4例;不稳定性斑块Bax阳性表达免疫组化10例,原位杂交11例,TUNEL阳性表达9例,表达显著高于稳定性斑块(P<0.01);免疫组化和原位杂交阳性细胞半定量计数在稳定性斑块中分别为8.63±2.62和10.32±3.12,在不稳定性斑块分别为122±21.64和152±23.35,高于稳定性斑块(P<0.01);对照组无表达。结论Bax高表达是影响粥样斑块稳定性的分子病理学基础和脑卒中发生率的因素之一,在不同时期控制其表达可为基因治疗颈动脉粥样硬化提供靶点。 相似文献
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目的建立实时荧光定量PCR检测皮层肌动蛋白基因表达水平的方法。方法提取人肝癌组织总RNA,RT—PCR扩增CTTN和GAPDH基因片段并分别构建两片段阳性表达载体。采用SYBR Green I实时荧光定量PCR绘制两基因拷贝数标准曲线,实测人肝癌标本并进行方法学评价。结果成功构建pMD18-T(+)/CTTN和pMD18-T(+)/GAPDH重组质粒。CTTN和GAPDH基因模板拷贝数分别在1.6×10^3-1.6×10^7和1.6×10^4-1.6×10^7之间时标准曲线有良好线性关系,R^2分别为0.996和0.985。由Ct值统计两基因组内变异系数分别为0.11%~2.25%和0.75%-3.63%;组间变异系数分别为0.83%~1.48%和0.47%~1.36%。组间无统计学差异(P〉0.05)。结论成功建立实时荧光定量PCR检测人肝癌组织CTTN基因的方法,为研究人肝癌组织CTTN基因表达水平奠定了方法学基础。 相似文献
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