烟草转基因检测标准及PCR反应体系的研究

通过对PCR体系和反应条件的优化,确定了针对35s启动子序列进行转基因检测的最佳反应体系和反应条件,利用纯阳性模板经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳确认1ng模板DNA为纯阳性样品理想扩增下限,同时以不同阳性含量的干烟叶为材料,确定了烟叶转基因检测的标准为0.1%,建立了转基因外标定量法,并通过已知阳性含量样品的检测对该反应体系和检测标准进行了结果验证      

多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

多重荧光定量PCR快速鉴定转基因玉米品系

采用多重实时荧光 PCR技术的高通量特征,对转基因玉米MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140的特异性靶标序列设计TaqMan-MGB荧光探针,通过退火温度和引物探针浓度梯度优化建立了四重实时荧光PCR检测方法,经特异性,重复性和灵敏性等方法学验证确认了方法的可靠性。MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140四个特异性基因的标准曲线回归方程分别为y=-3.263x+36.632,y=-3.422x+36.384,y=-3.294x+38.978和y=-3.278x+37.514;Ct值变化范围分别在23.556～37.524,22.893～37.412,25.304～39.110和24.501～37.618之间;标准偏差分别在0.078～0.476,0.085～0.463,0.120～0.487和0.148～0.353之间;相关系数R2分别为0.997,0.996,0.995和0.993;检出限可达10个拷贝,扩增效率满足欧盟等国际要求。该方法一管多检,操作简便,成本较低,适用于大批次样本的高效分析检测,为转基因产品合规使用和进出口食品安全监测提供方法参考。     

转基因食品的快速PCR鉴定

用十六烷基-二甲基-乙基-溴化铵(CTAB)法快速高效地从样品中提取了可供分析的基因组DNA,经PCR扩增,鉴定了含有35S启动子和NOS终止子的转基因样品.该方法的灵敏度可达0.1%,并且具有很好的稳定性.     

转基因烟草定性检测方法的研究

本文总结多年的试验研究结果,提出了一套较为完善的转基因烟草定性检测技术,应用该技术,能使转基因烟草的检测精确度由常规PCR的0.1%提高到0.005%。该技术在两次CORESTA转基因烟草盲检合作试验及多年的进出口烟叶、卷烟制品的转基因检测工作中得到广泛的验证。      

烟草转基因内标准定量检测中竞争性模板的制备

以转基因烟草为材料，通过DNA提取、PCR扩增获得NOS终止子片段产物，以重叠延伸扩增法制备该片段的竞争性模板，并进行酶切验证。     

转基因玉米的七重PCR鉴定方法

以玉米内源基因IVR、外源抗除草剂基因(BAR、PAT)、抗虫基因Cry1Ab、筛选基因NPTII、CaMV35S启动子和NOS终止子为检测的目的片段,分别设计了7对引物,通过研究较佳引物终浓度配比和退火温度,建立了玉米转基因成分七重PCR检测体系。结果表明,建立的七重PCR体系用于同时检测内源基因和转基因成分是可行的,检测方法效率高、稳定性好。     

转基因烟草检测方法研究进展

随着烟草国际贸易的发展,转基因烟草产品的检测成为烟草贸易关注的热点。目前对于转基因烟草产品的检测方法主要有两种,一种是以DNA为基础的PCR法,另一种是以蛋白质为基础的ELISA法。笔者主要论述了转基因烟草PCR检测法的研究进展,这对开展转基因烟草检测的研究工作有一定的参考价值。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

转基因玉米品系及转化体成分四重实时荧光PCR快速鉴定

Bt11转基因玉米品系具有抗草铵膦除草剂,鳞翅目昆虫抗性的耐除草剂抗虫玉米,MIR162和Mon89034是鳞翅目昆虫抗性的单抗虫玉米,均是国内外出入境监管主要关注的转基因玉米品系。本研究通过靶标基因筛选,转基因阳性样品采集,核酸样本制备,多重引物和荧光探针组合筛选,反应体系优化以及方法学验证等过程开发建立了四重荧光定量PCR检测技术。结果表明该技术的使用可实现一个反应管中同时检测MIR162、Bt11、Mon89034三个玉米品系的特异性基因序列和一个编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2 (zSSIIb) 玉米内源基因。通过阳性对照,阴性对照和空白对照特异性S曲线与对应的阈值大小分析可判定样品中是否含有这三个转基因玉米品系及其转化体成分。经方法学特异性检测,结果与转基因检测金标准的单实时荧光PCR结果一致;经平行样和灵敏度测试,最低检测限为18个拷贝;经标准曲线扩增分析,四个基因的扩增效率均在90%~110%范围内,扩增效果良好。该方法从DNA提取到报告结果不足3小时,可缩短检测时限,节约试剂耗材成本,操作简单易行,满足高通量特征,可为市场流通产品品系和转基因成分的实时监管和快速鉴定提供技术支撑。     

转抗虫基因烟草NC89纯合品系的获得及大田抗虫试验

经过连续三代抗虫性鉴定，选育出了表达直豆胰蛋白酶抑制剂（ＣＰＴＩ）的广谱抗虫转基因烟草ＮＣ８９纯合品系ＮＣ８９Ｌ２７－１９和ＮＣ９８Ｌ２７－２１。在大田对两个纯合系的抗虫性状进行了研究。①人工接种烟青虫；②害虫自然发生，不施杀虫剂；③在同一虫害防治阈值时施用杀虫剂。结果表明：转基因品系可稳定表达抗虫性状。在不施用杀虫剂时，田间相对抗虫效果在６４．７％～７０．５％之间；在施用杀剂时，可减少用药量４０％左右。转基因品系仍维持原ＮＣ８９主要植物学特性及农艺性状，为ＮＣ８９品种的抗虫改良品系。     

荧光定量PCR检测霉变烟叶中米曲霉方法的建立

为建立快速高效的烟草霉变微生物定量与定性的检测方法,本研究针对陈旧烟叶中分离的米曲霉的rDNAITS1基因片设计一对特异引物,制备含ITS1基因的重组质粒作为阳性对照,建立了米曲霉基因组的SYBR Green I应该定量PCR检测方法。结果显示,标准曲线的相关系数为0.998,最低可检测浓度为101copy/μL的阳性质粒,与其他的微生物的基因组不发生交叉反应,该技术可为检测烟叶霉变微生物提供快速可靠的检测手段。     

烟草T-DNA插入位点侧翼序列扩增方法的筛选与优化

烟草T-DNA激活标签插入突变体库的创制过程中,需要进行大量的T-DNA插入位点的侧翼序列扩增,因此选择一种适用于烟草T-DNA侧翼序列扩增的高效方法尤为必要。本研究比较了TAIL-PCR、PCR-walking、FPNI-PCR三种方法对T-DNA插入位点侧翼序列的扩增效率、插入位点确定的比例和同源蛋白比对结果,并对3种方法的PCR程序、体系和引物设计等方面进行了优化,确定TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增,通过产率、条带长度、插入位点和同源蛋白比对结果的比较,得出TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增。这一结果为应用烟草突变体开展烟草基因功能的研究奠定了基础。     

酶技术改善烟叶品质的研究进展

酶在烟叶调制,陈化和贮存期间起着非常重要的作用.近年来关于如何利用外加酶改善烟叶内在品质已经成为烟草行业的热点话题.利用酶制剂可以降解烟叶中过量的淀粉、蛋白质、细胞壁物质和果胶质,增加香气和改善质量品质.另外,酶制剂在烟草添加剂、烟草香料、烟草薄片中的应用,酶制剂和微生物配合使用的研究也在增加.     

转基因稻米加工食品的PCR检测技术研究

本文对转基因稻米及其加工食品进行了针对标记基因bar、CaMV35S启动子和Nos终止子DNA序列的PCR检测.结果表明,改良SDS法适于提取转基因稻米以及经过蒸煮、微波膨化加工后稻米食品中的DNA并能够满足PCR检测的需要.食品加工使稻米基因组DNA降解为较小的片段,但不影响PCR检测效果,PCR技术能够检测稻米加工食品中的转基因成分.     

双向等位基因特异性PCR技术在烟草SNP分型中的应用

为提高抗PVY烟草品种的分子育种效率,本研究针对抗病种质资源半坤村晒烟中隐性抗病基因eIF4E1的SNP位点G149C建立一种简单快速的双向等位基因特异性PCR (Bi-directional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)检测方法,并对该检测方法的特异性、准确度及实际应用效果进行验证。结果表明,建立的Bi-PASA检测方法能够在一个PCR反应中有效区分eIF4E1基因G149C位点3种基因型:野生型GG、杂合突变型GC、纯合突变型CC。利用Bi-PASA检测方法可以对K326×半坤村晒烟F₂分离群体的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与普通的等位基因特异性PCR (allele-specific PCR,AS-PCR)以及直接测序法的鉴定结果一致。综上所述,本研究建立的Bi-PASA检测方法特异性强、准确度高、操作简便,可更好地应用于eIF4E1基因的分子标记辅助育种。     

利用PCR方法检测转BT基因水稻

应用PCR技术进行转基因水稻检测研究。本文以转基因水稻为材料，以聚合酶链式反应（PCR）方法为基础，选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术，针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子、胭脂碱合成酶（NOS）终止子、和转入苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，简写为Bt）基因水稻的CrylAc片段进行PCR检测，建立适合转BT基因水稻的检测方法。该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符。     

多重PCR法检测转Bar、Bt基因双抗稻米

旨在建立一种快速、有效的检测转基因双抗稻米的方法,以转Bar、Bt基因双抗稻米为原料,针对其水稻内源基因SPS和外源基因(包括Bar基因、Bt基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子和NOS终止子)设计多重PCR检测体系。结果表明,应用该多重PCR检测体系可快速检测出原料中的全部6条目标基因,检测灵敏度可达0.9%。