附子人参配伍对CYP1A2和CYP3A4酶活性的影响

目的:通过建立"Cocktail"探针药物法及体外肝微粒体孵育体系,测定大鼠肝微粒体中CYP1A2和CYP3A4酶的活性,探索附子配伍人参对附子主要成分乌头类生物碱的代谢酶CYP1A2和CYP3A4酶活性的影响。方法:采用"Cocktail"探针药物法,利用CYP1A2和CYP3A4酶的特异性探针底物咖啡因和咪达唑仑,建立同时测定两种探针底物的体外肝微粒体孵育体系;采用RP-HPLC法测定两种探针底物在大鼠肝微粒体孵育体系中的浓度,计算CYP1A2和CYP3A4酶活性的变化。结果:与空白组比较,附子组、人参组、附子人参组对CYP1A2酶活性没有影响,附子组、附子人参组对CYP3A4酶活性没有影响,人参组对CYP3A4酶活性有抑制作用,进而减慢附子主要药效成分乌头类生物碱的代谢,因此,从代谢酶角度可以阐释,附子人参配伍能够增强附子的药效。     

HPLC法同时检测大鼠血浆中3种细胞色素P450探针药物

目的:建立同时检测大鼠血浆中3种细胞色素P450(CYP450)探针药物,即氯唑沙宗(CYP2E1)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)和咪达唑仑(CYP3A4)的高效液相色谱方法。方法:色谱条件选用Topsil TM C_(18)column(250mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇-(NH_4)_2HPO_4(54∶46,p H值为3.4);检测波长230nm;流速1.0m L·min~(-1);柱温30℃。结果:氯唑沙宗、咪达唑仑、甲苯磺丁脲的线性范围分别为0.2～50,0.2～50,0.1～50μg·m L~(-1);方法回收率分别为96.22%～101.42%,98.72%～104.14%,97.09%～105.27%。结论:该HPLC检测方法快捷,准确,灵敏度高,符合生物样品分析要求,适用于同时测定3种CYP450酶亚型探针药物的大鼠血浆药物浓度,可为相关肝药酶代谢研究提供方法学参考。     

溃疡汤对大鼠体内奥美拉唑药动学的影响

目的考察溃疡汤干预后,大鼠肝微粒体CYP2C19活性的变化。方法大鼠经溃疡汤预处理后,分别于体内和体外考察奥美拉唑在预处理大鼠体内药动学。结果大鼠经溃疡汤干预后,奥美拉唑的药动学参数显示MRT和t_(1/2z)显著降低,CL_z显著升高,差异具有极显著统计学意义(P0.01),溃疡汤组大鼠的AUC也成降低趋势。预处理大鼠肝微粒CYP2C19的表达提高。结论初步推断溃疡汤可能诱导CYP 2C19酶的活性。     

人源细胞色素P450 2E1与细胞色素P450氧化还原酶的共表达

目的利用大肠埃希菌(E.coli)表达系统异源表达细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1),并与细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)实现共表达,使其具有代谢活性,为药物代谢的研究提供单一性的酶源。方法以人肝组织RNA为模板,RT-PCR扩增CYP2E1基因,插入pCW空载体,构建重组表达质粒pCW-2E1,转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定;利用双启动子原理构建CYP2E1与POR共表达的重组质粒pCW-2E1-POR,采用对氨基苯酚法检测CYP2E1重组酶的代谢活性,并对不同培养时间(18、28、38 h)的代谢活性进行比较。结果质粒pCW-2E1经PCR鉴定,证明构建正确;表达的重组人CYP2E1蛋白相对分子质量约56 000,主要以可溶性形式表达。质粒pCW-2E1-POR经PCR及酶切鉴定,证明构建正确;导入质粒pCW-2E1-POR的重组菌提取的蛋白样品具有明显的代谢活性,培养18、28、38 h后,代谢活性均值分别为(0.195±0.004)、(0.189±0.003)和(0.192±0.004)nmol/(min·mg),差异无统计学意义(P0.05),但与导入质粒pCW-2E1的重组菌提取的蛋白样品的代谢活性相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建了具有代谢活性的CYP2E1重组酶,且3个培养时间段之间的代谢活性无明显差异。     

一种HPLC同时测定大鼠血浆中CYP450五种同工酶探针药物浓度的新方法

目的:建立HPLC法同时测定大鼠血浆中5种同工酶探针药物浓度的方法。方法采用氯仿提取五种探针药物,Topsil C_(18)色谱柱(250mm×4.6mm 5μm),流动相以甲醇-磷酸氢二铵缓冲液(pH值3.4)梯度洗脱。检测波长230nm,流速1.0mL·min~(-1),柱温35℃。结果:5种探针药物在0.2～50μg·m L~(-1)范围内线性关系良好,方法提取回收率咖啡因98.08%～98.25%,美托洛尔97.81%～101.61%,氯唑沙宗99.92%～102.53%,甲苯磺丁脲98.83%～105.82%,咪达唑仑96.58%～101.47%.结论:该方法样品处理简便,专属性好,快速、准确、经济,可应用于五种同工酶探针药物的同时测定,适合进行药物对CYP450酶同工酶(CYP1A2、2D4、2E1、2C11和3A2)活性的影响及药物相互作用研究。     

冷应激前后大鼠肺脏、肾脏、肌肉及十二指肠α-烯醇化酶基因的定量

目的研究急性冷刺激对大鼠肺脏、肾脏、肌肉及十二指肠α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1)基因表达量的影响。方法取健康大鼠10只,随机分为2组:冷应激组和正常对照组,每组5只。正常对照组饲养环境为24℃,冷应激组大鼠环境温度为4℃,应激时间为12 h。实验后分别取两组大鼠肺脏、肾脏、肌肉及十二指肠组织样品,应用实时荧光定量PCR检测应激前后大鼠四种内脏器官ENO1 m RNA表达量。结果冷应激组肺脏与十二指肠ENO1 m RNA表达水平显著高于正常对照组(P0.05);肾脏与肌肉ENO1 m RNA表达水平显著下降(P0.05)。结论急性冷刺激可通过影响肺脏、肌肉、肾脏及十二指肠ENO1基因表达调节代谢燃料的选择和应激反应程度。     

腰痹通胶囊中主要成分在不同种属肝微粒体中代谢物谱及稳定性研究

本研究旨在应用肝微粒体孵育技术研究腰痹通胶囊中主要成分在不同种属肝微粒体（人、食蟹猴、比格犬、大鼠和小鼠）中I相代谢物谱及稳定性差异。采用UPLC-Q-TOF技术寻找腰痹通胶囊孵育样品中可能的代谢产物,采用UPLC-TQ技术测定腰痹通胶囊孵育样品中主要成分的含量变化。结果表明,腰痹通胶囊中蛇床子素在不同种属肝微粒中的I相代谢物谱和代谢稳定性均有明显差异,而其他主要成分在不同种属肝微粒体中代谢较稳定,代谢差异不明显。     

7,12-二甲基苯并蒽对人肝星状细胞活化的影响

探讨7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)对肝星状细胞活化的影响。DMBA(1μmol·L-1)处理人肝星状细胞株LX-2 24h后,Western blot、ELISA和实时定量PCR观察肝星状细胞活化标志蛋白α-SMA、TGF-β1、CYP1A1和CYP1B1蛋白表达和分泌量以及mRNA表达。研究发现,与对照组相比,DMBA处理后的LX-2中α-SMA蛋白和mRNA表达均显著升高(P0.05),TGF-β1分泌量(P0.05)和mRNA表达(P0.01)也显著升高。此外,DMBA处理的LX-2中CYP1A1和CYP1B1的mRNA表达也显著升高(P0.05)。结果表明DMBA可活化人肝星状细胞,可能与诱导LX-2中CYP1A1和CYP1B1表达有关。     

清营汤对大鼠体内非那西汀与咪达唑仑药动学的影响

考察清营汤对非那西丁和咪达唑仑在大鼠体内药代动力学的影响,进而探讨清营汤对CYP1A2和CYP3A1酶活性的影响。将大鼠随机分为空白对照组和清营汤组,清营汤组大鼠连续给药10 d,空白对照组大鼠给予相同体积生理盐水。第11 d,大鼠分别静脉注射非那西丁和咪达唑仑,高效液相色谱法分别测定非那西丁和咪达唑仑的血药浓度,DAS2.0软件计算药动学参数。结果清营汤组大鼠体内的非那西丁药代动力学参数较正常对照组出现显著差异,代谢速率加快;但是清营汤对咪达唑仑在大鼠的药代动力学特征没有显著影响。实验清营汤可能诱导大鼠体内的CYP1A2活性,但是对CYP3A1没有显著影响。     

CYP1B1抑制剂研究进展

CYP1B1酶(Cytochrome P450 1B1,CYP1B1)是细胞色素P450酶(Cytochrome P450 enzyme, CYPs)的一个亚族，能参与多种内、外源性化合物的氧化/还原反应，在多种恶性肿瘤中高表达。CYP1B1酶逐渐成为抗肿瘤药物设计研发的热门靶点，许多学者以CYP1B1酶为靶标蛋白设计的抑制剂，表现出较好的活性和巨大的应用潜力，尤其是在克服肿瘤耐药性中具有重要意义。目前报道的CYP1B1抑制剂种类繁多，活性最佳的化合物是α-萘黄酮(ANF)。主要介绍了较为常见的几类CYP1B1抑制剂，简述了各类化合物的特点以及酶抑制效果，并对CYP1B1抑制剂的发展前景进行了展望。     

冷应激前后大鼠心脏、肝脏及脾脏中α-烯醇化酶基因mRNA的转录水平

目的研究冷应激前后大鼠心脏、肝脏、脾脏中α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1)基因m RNA的转录水平。方法将大鼠随机分为正常对照组(24℃,正常饲喂7 d)和冷应激组(置4℃,应激12 h),提取各组大鼠心脏、肝脏及脾脏细胞总RNA,反转录成c DNA,以其为模板,PCR扩增ENO1基因,应用生物信息学软件DNAstar进行同源性分析,实时荧光定量PCR法检测大鼠心脏、肝脏、脾脏中ENO1基因m RNA的转录水平。结果冷应激前后大鼠心脏、肝脏及脾脏总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5S 3条带,A260/A280值为1.8~2.0;ENO1基因经2%琼脂糖凝胶电泳分析可见107 bp的目的基因条带;ENO1基因序列与NCBI上公布序列的同源性为100%;冷应激组大鼠肝脏、脾脏组织中ENO1基因m RNA的转录水平明显高于正常对照组(P0.01),正常对照组大鼠心脏组织中ENO1基因m RNA转录水平明显高于冷应激组(P0.05)。结论冷应激前后大鼠心脏、肝脏及脾脏中ENO1基因m RNA的转录水平均发生显著改变,本实验为动物应激状态评估及应激发生机制的研究提供了实验依据。     

冷应激对大鼠肝脏组织中Rap1b表达的影响

目的探讨冷应激对大鼠肝脏组织中Rap1b表达的影响。方法将20只Wistar大鼠随机分为常温饲养组和冷应激组,每组10只,正常饲养温度为(24.0±0.1)℃,冷应激温度为(4.0±0.1)℃。经12 h冷刺激后,采集大鼠肝脏组织,提取总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果冷应激组大鼠肝脏组织中Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白表达水平均显著高于常温饲养组(P0.01)。结论冷应激可显著提高大鼠肝脏组织中Rap1b基因m RNA的转录水平和蛋白表达水平。     

慢病毒介导siRNA对大鼠脊髓组织细胞外信号调节激酶1/2及核因子E2相关因子2基因的影响

目的评价慢病毒介导细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)-si RNA及核因子(nuclear factor,NF)E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)-si RNA进入大鼠局部脊髓组织的转染效果。方法采用NYU撞击法构建SD大鼠脊髓损伤模型(模型组),使用微量注射器将含荧光慢病毒载体(LV-Nrf2-RNAi和LV-ERK1/2-RNAi)稀释液注射至其脊髓T10水平背侧深约0.8 mm处,荧光显微镜下观察不同时间点(12 h、24 h、72 h、7 d及14 d)转染效果。以只切除椎板,不打击脊髓的大鼠作为假手术组,在模型组和假手术组中同时设转染组和未转染组。取大鼠脊髓组织,采用RT-PCR及Western blot法检测转染后7 d时ERK1/2及Nrf2基因m RNA转录及蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠脊髓组织在慢病毒转染后各时间点均有较强的荧光表达,病毒转染7 d以内,荧光强度与时间呈正相关,在转染7 d后达到高峰。转染7 d后,假手术组与模型组中ERK1/2及Nrf2基因m RNA转录及蛋白表达水平均较未转染组明显降低(P均0.05)。结论慢病毒介导si RNA转染大鼠脊髓组织,能够有效沉默ERK1/2及Nrf2基因的表达。     

杜仲中环烯醚萜类物质对性激素转化的调控作用

杜仲是中国传统名贵滋补药材,有补益肝肾、强筋壮骨、固经安胎的功效,而这些功效与性激素水平息息相关,故本文研究了杜仲中3种主要的环烯醚萜类物质（京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸）对性激素的转化作用。以卵巢颗粒细胞的肿瘤细胞系KGN作为激素的转化系统,孕烯醇酮为转化底物,分别测量环烯醚萜类物质干预24h后培养基中的孕酮、睾酮以及雌二醇的浓度,并提取细胞的RNA,以反转录实时荧光定量法来研究其催化酶3β-HSD、CYP17A1以及17β-HSD表达水平的影响。研究结果表明,50 μmol/L的京尼平能显著提升3β-HSD、CYP17A1以及17β-HSD的表达水平,从而显著促进睾酮和雌二醇的合成。     

磷酸酶张力蛋白同系物基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建携带磷酸酶张力蛋白同系物(phosphoatase and tensin homolog,PTEN)基因的sh RNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。方法在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的psh RNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的psh RNA,将其克隆至重组穿梭载体p Shuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒p Shuttle-GFP-PTEN-sh RNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体p Adxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA。将重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA,经3轮扩增,测定病毒滴度。荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。结果与空白对照组比较,psh RNA1和psh RNA3组中PTEN基因m RNA表达量分别下降了44%和68%(P<0.05,确定p GPU6/GFP/Neo-PTEN-sh RNA3为最佳转染质粒);重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42%和51%(P<0.05)。结论成功构建了PTEN基因sh RNA重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础。     

间充质干细胞对急性肝衰竭的治疗及移植途径的优化

目的探讨脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)对急性肝衰竭大鼠的治疗作用及移植途径的优化。方法将48只SD大鼠随机分为4组:空白对照组、模型对照组以及移植治疗A、B组,每组12只,模型对照组和移植治疗组大鼠均经腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液,造模后24 h,模型对照组经尾静脉注射1 ml生理盐水,空白对照组和移植治疗A组均经尾静脉注射1 ml hUCMSCs悬液,移植治疗B组经肝叶注射0.3 ml hUCMSCs悬液。移植治疗后多时间点收集血清,采用全自动生物化学分析仪检测白蛋白(albumin,ALB)、总胆红素(total bilirubin,TBil)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)含量;移植治疗后1和2周,采用Real-time PCR法检测各组大鼠肝组织中人CK8、CK18和AFP基因水平;移植治疗后3 d、1和2周,采用免疫组化SP法检测各组大鼠肝组织中人CK18蛋白的表达。结果移植治疗后24、48 h,移植治疗组与模型对照组相比,ALB、TBil和ALT含量差异有统计学意义(P均<0.05);移植治疗后1和2周,与模型对照组相比,移植治疗A和B组CK8、CK18和AFP基因水平均明显升高(P均<0.01),随造模时间的延长,基因水平也逐渐升高;移植治疗后3 d,大鼠肝脏组织中可检测到人CK18蛋白的表达,hUCMSCs在大鼠肝组织中诱导分化后,从汇管区向肝小叶中央迁移扩散;移植治疗A和B组的肝功能指标、移植细胞分化程度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论hUCMSCs能促进急性肝衰竭大鼠肝脏的修复,同时自身能分化为具有肝细胞功能的类肝样细胞,经尾静脉注射移植与经肝叶注射移植疗效相似,前者更易于应用和推广。     

地高辛标记Nkx2.1基因RNA探针的制备及应用

目的制备地高辛(digoxigenin,DIG)标记的Nkx2. 1基因RNA探针,用于小鼠胚胎早期神经管发育关键时期Nkx2. 1基因表达的检测。方法巢式PCR法扩增Nkx2. 1基因,将其克隆至pGEM-T载体;以其为模板,通过Nkx2. 1特异性引物,PCR扩增RNA探针转录模板;采用T7 RNA聚合酶,制备DIG标记的正义、反义Nkx2. 1 RNA原位杂交探针。经全胚胎原位杂交(whole-mount in situ hybridization,WM-ISH)技术分析胚胎8. 5、9. 5、10. 5 d小鼠体内Nkx2. 1基因的表达情况。结果制备的探针浓度为1 521. 986 ng/mL,纯度A260/280=2. 39。Nkx2. 1基因反义探针能高效检测到Nkx2. 1基因在胚胎8. 5、9. 5及10. 5 d小鼠神经系统中表达,正义探针未能检测到表达信号。结论成功制备了特异高效的DIG标记的Nkx2. 1基因RNA原位杂交探针,为进一步研究Nkx2. 1基因在小鼠胚胎组织中的表达,探索其在神经管发育中的作用机制奠定了基础。     

肿瘤转移抑制基因1及Gli1基因在子宫内膜腺癌细胞系中的表达

目的探讨肿瘤转移抑制基因1(metastasis suppressor 1,MTSS1)及Gli1基因在子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa和HEC-1A中的m RNA的转录及蛋白表达水平。方法体外培养子宫内膜高分化腺癌细胞系Ishikawa和中分化腺癌细胞系HEC-1A细胞,采用RT-PCR和Western blot法分别检测两株癌细胞系中MTSS1和Gli1基因m RNA的转录及蛋白的表达水平。结果子宫内膜高分化腺癌细胞系Ishikawa中MTSS1基因m RNA的转录及蛋白的表达水平显著高于中分化细胞系HEC-1A(P0.05),Ishikawa细胞系中Gli1基因m RNA转录及蛋白表达水平显著低于HEC-1A细胞系(P0.05)。结论 MTSS1可能作为转移抑制基因,通过调控Sonic hedgehog(Shh)信号通路参与子宫内膜腺癌的发生发展,为进一步研究子宫内膜腺癌的发生发展机制奠定了基础。     

贾第虫核糖核酸酶PRNA转录本3′端序列及其存在形式

目的确定贾第虫滋养体内核糖核酸酶P(RNase P)RNA 3′端序列及其存在形式。方法提取贾第虫滋养体总RNA,大肠埃希菌(E.coli)Poly(A)聚合酶加polyA尾后,进行反转录,扩增出加polyA尾后的cDNA,经PCR及测序进行鉴定,确定其3′端序列。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测RNase P-GLsR15共转录体与RNase PRNA成熟体的总表达量,两者之差即为RNase P RNA成熟体的表达量,确定贾第虫RNase P RNA的存在形式。结果 RNase P RNA 3′cDNA大小约300 nt,3′端序列与GLsR15 3′端序列一致;RNase P-GLsR15共转录体和RNaseP RNA成熟体的总表达量与RNase P-GLsR15共转录体表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论已成功克隆了RNase P RNA 3′端序列,证实RNase P RNA和GlsR15的共转录体即为RNase P RNA成熟体的存在形式。     

α-烯醇化酶在籽鹅不同级别卵泡壁的定位及定量

目的对籽鹅不同级别卵泡壁中的α-烯醇化酶(α-enolase)进行定位及定量检测。方法分离产蛋期籽鹅等级卵泡(F1、F2、F3、F4、F5)、小黄卵泡(small yellow follicle,SYF)、大白卵泡(large white follicle,LWF)的卵泡壁;应用免疫组化方法检测不同级别卵泡壁的α-烯醇化酶的定位,采用Western blot及实时荧光定量PCR双标准曲线法检测α-烯醇化酶蛋白表达量及mRNA转录水平。结果不同级别卵泡壁均存在α-烯醇化酶表达,颗粒细胞层表达量总体高于膜层,SYF颗粒细胞层α-烯醇化酶表达量较高;F2级卵泡壁α-烯醇化酶mRNA转录水平显著高于LWF、F3及F4级别卵泡,差异有统计学意义(P 0. 01),F1、F5及SYF级卵泡壁α-烯醇化酶m RNA转录水平显著高于其他级别卵泡壁,差异有统计学意义(P 0. 01);SYF级卵泡壁α-烯醇化酶蛋白表达量显著高于其他级别卵泡,差异有统计学意义(P 0. 01)。结论α-烯醇化酶及糖酵解途径可能在卵泡发育中发挥重要功能,为α-烯醇化酶在禽类卵泡选择及生长发育中的功能研究奠定了基础。