应用溶氧反馈控制高密度培养重组大肠杆菌过程中乙酸的产生

在培养重组大肠杆菌的过程中,乙酸的产生会抑制细菌的生长,也不利于重组蛋白的表达.研究了补料培养重组大肠杆菌过程中,应用脉冲补料方式时溶氧信号的响应特征来辩识是否产生乙酸.当大肠杆菌以0.1 h-1的比生长速率生长时,补料过程中发酵液的乙酸含量很低,溶氧pO2的响应信号随脉冲补料而振荡.而在诱导表达重组人表皮生长因子时,大肠杆菌的呼吸能力下降,过量补入的葡萄糖使重组菌产生大量的乙酸,同时pO2的响应信号失去振荡的特征.根据pO2响应信号的特征反馈控制葡萄糖的流加速率,有效地避免了重组蛋白表达过程中乙酸的产生,实现了重组大肠杆菌的高密度培养,菌体干重达到48 g·L-1,重组人表皮生长因子的表达水平提高了45%.     

大肠杆菌高密度培养研究进展

对大肠杆菌高密度培养的影响因素、培养方法等方面的最新进展进行了综述,并对基因工程技术在大肠杆菌高密度培养中的最新应用进行了介绍。     

补料技术在大肠杆菌高密度培养中的研究进展

补料技术是大肠杆菌高密度培养的重要技术。本文对补料技术在大肠杆菌高密度培养中应用的研究进展进行了综述,主要包括补料技术的种类、各类技术的优缺点等。     

重组大肠杆菌产耐热α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵条件的优化

为了减少乙酸的生成,提高重组大肠杆菌生产耐热α-L-鼠李糖苷酶的产量,考查了指数流加培养、两阶段指数流加培养、诱导温度、诱导pH对重组大肠杆菌发酵生产耐热α-L-鼠李糖苷酶(TstRhaA)过程中乙酸含量和酶产量的影响。确定最佳发酵工艺：诱导前比生长速率0.2 h^-1,诱导后比生长速率0.18 h-1,诱导温度33℃,p H 7.2。在最佳发酵工艺条件下,乙酸浓度始终保持在0.8 g/L以下,菌体干重(DCW)最大为69.6 g/L,最高酶活力为589.0 U/mL,是摇瓶发酵的23.4倍,实现了重组大肠杆菌高密度发酵生产TstRhaA。研究结果表明,调节大肠杆菌高密度发酵过程中乙酸含量在合适范围内,能够实现TstRhaA的高效生产,这对其他酶的高密度表达具有重要指导意义。     

基因重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白补氮策略优化研究

优化重组大肠杆菌高密度发酵的调控工艺.利用重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白,考察了连续流加和分阶段式两种不同补氮策略对细胞生长和类人胶原蛋白产量的影响.不同补氮方式显著影响类人胶原蛋白的产量.分阶段式补氮方式优于连续流加补氮方式,有利于细胞生长和类人胶原蛋白的表达,最终细胞浓度为76.01 g·L-1(DCW),类人胶原蛋白浓度为16.75 g·L-1,蛋白表达量为22.1%.     

重组大肠杆菌产胆固醇氧化酶的指数流加策略

以指数流加策略高密度培养重组大肠杆菌,发酵生产胆固醇氧化酶。通过对比生长速率的分阶段控制使得细胞干重达40.128g/L。确定了最佳的诱导时机为菌体对数生长期的中期,产酶速率为1287.31U/(L·h)。菌体产酶水平达6436.56U/L,生产强度为459.75U/(L·h),实现了胆固醇氧化酶的高效生产。     

纤溶酶原饼环区5蛋白重组大肠杆菌高效表达体系的建立

目的　建立纤溶酶原饼环区 5 (Humanplasminogenkringle 5 ,hPK 5 )蛋白重组大肠杆菌高效表达体系 ,为高密度发酵创造条件。方法　观察一级、二级种子的生长状态 ,比较表达hPK 5蛋白的 4种重组工程菌株在相同条件下的表达情况 ,选出首选发酵种子 ;对其培养时间、诱导时间、培养基种类、pH等条件进行优化 ;并用凝胶成像分析系统对SDS PAGE结果进行分析。结果　经过筛选 ,JM10 9 pBV2 2 0 hPK 5 (简称JP5 )是获取hPK 5蛋白的首选工程菌株 ,其最佳表达条件是LB培养基 (pH 7.4、溶解氧充足 )、30℃培养 3h、4 2℃诱导 6h。在此条件下 ,JP5表达目的蛋白占菌体总蛋白的 38%左右。结论　为高密度发酵获取hPK 5蛋白奠定了实验基础     

密码替换后人促红素基因在大肠杆菌中的高效表达及工程菌的发酵

目的　研究人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中高效表达及工程菌高密度发酵条件。方法　将hEPO基因中大部分大肠杆菌稀有密码子替换成使用频率较高的密码子 ,人工合成hEPO全基因 ,然后将其插入表达载体PBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,挑选构建正确的PBV2 2 0 hEPO DH5α菌落 ,经升温诱导 ,SDS- PAGE和Westernblot鉴定表达产物 ;观察改变培养基、培养时间、pH及溶氧量等条件对表达产物的影响。结果　经酶切分析 ,DNA测序鉴定 ,人工合成的hEPO基因已正确构建到表达载体中。通过高密度发酵培养 ,最终菌体密度达A6 0 0 =30 (相当于菌体 35g L) ,hEPO表达量达 30 %左右。结论　人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中得到高效表达 ,并确定了该工程菌高密度发酵的适宜条件。     

《中国生物制品学杂志》2003年第16卷总目录

论著 汉坦病毒核蛋白基因截短片段在大肠杆菌中表达 及其产物的初步应用(1) 汉坦病毒76一118株GZ基因的克隆及其在甲基营 养型酵母中的表达(5) 人白细胞介素一18的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达(9) 胸腺素。l的基因合成、表达及活性测定(13) 可溶性重组蛋白EGF一Ang构建及体外细胞毒性检测(16) 生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与 表达(19) 重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛙素过程中的产物生成 和降解(24) 甲肝和麻疹病毒混合感染人胚肺二倍体细胞病毒增殖动 态及细胞相互作用的研究(28) 含presZ免疫表位乙肝表面抗原D…     

抗肝癌hdsFv-hEDN重组免疫毒素的表达及生物学活性

目的制备对人肝癌细胞具有特异性杀伤活性的抗肝癌重组免疫毒素。方法利用大肠杆菌系统表达抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素。表达产物经NiNTA亲和层析纯化后,进行特异性杀伤活性检测。结果抗肝癌hdsFvhEDN重组免疫毒素以可溶性形式表达于大肠杆菌培养上清中,并获得有效纯化。ELISA法检测证实其具有与相应抗原特异性结合的活性。细胞毒试验表明对肝癌细胞具有杀伤作用,而对正常肝细胞无损伤。结论已成功地制备了具有特异性结合和杀伤活性的抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素,为其进一步应用奠定基础。     

基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响

考察E.coli JM001及其重组菌株E.coli JM002生物发酵生产丁二酸的性能。E.coli JM001在两阶段发酵产丁二酸过程中通过在有氧培养阶段添加乙酸钠,即可提高丁二酸的生产能力,厌氧阶段的丁二酸收率可达84%,但会有较多的副产物乙酸和丙酮酸积累。以E.coli JM001为出发菌株,敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并导入来源于枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)基因,构建了重组菌株E.coli JM002,该重组菌株在两阶段发酵的有氧培养过程中不需添加乙酸钠,转厌氧后菌株也具有转化葡萄糖合成丁二酸的能力,丁二酸收率可达86%,副产物积累很少。     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。     

重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌生物学特性的稳定性

目的观察重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌pKKH-BLyS/DH5α生物学特性的稳定性。方法工程菌连续传50代,每10代进行目的蛋白表达水平、质粒性状检测、透射电镜观察、革兰染色及各项生化检查,观察工程菌生物学特性的稳定性。结果0、10、20、30、40和50代工程菌之间目的蛋白的表达量无明显差异,基本维持在40%左右;双酶切、PCR及测序结果均与原代质粒相符;革兰染色均呈阴性;透射电镜观察及各项生化反应均呈现典型的大肠杆菌特性。结论该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种。     

多策略代谢工程大肠杆菌高效生产辅酶Q10

Escherichia coli BW25113 was metabolically engineered for CoQ10 production by replacing ispB with ddsA from Gluconobacter suboxydans.Effects of precursor balance and reduced nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADPH) availability on CoQ10 production in E.coli were investigated.The knockout of pykFA along with pck overexpression could maintain a balance between glyceraldehyde 3-phosphate and pyruvate,increasing CoQ10 production.Replacement of native NAD-dependent gapA with NADP-dependent gapC from Clostridium acetobutylicum,together with the overexpression of gapC,could increase NADPH availability and then enhanced CoQ10 production.Three effects,overexpressions of various genes in CoQ biosynthesis and central metabolism,different vectors and culture conditions on CoQ10 production in E.coli,were all investigated.The investigation of different vectors indicated that low copy number vector may be more beneficial for CoQ10 production in E.coli.The recombinant E.coli (△ispB::ddsA,△pykFA and △gapA::gapC),harboring the two plasmids encoding pck,dxs,idi and ubiCA genes under the control of PT5 on pQE30,ispA,ddsA from Gluconobacter suboxydans and gapC from Clostridium acetobutylicum under the control of PBAD on pBAD33,could produce CoQ10 up to 3.24 mg·g-1 dry cell mass simply by changing medium from M9YG to SOB with phosphate salt and initial culture pH from 7.0 to 5.5.The yield is unprecedented and 1.33 times of the highest production so far in E.coli.     

A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon alpha as a GST-fusion protein in E. coli

Escherichia coli is the most extensively used host for the production of recombinant proteins. However, most of the eukaryotic proteins are typically obtained as insoluble, misfolded inclusion bodies that need solubilization and refolding. To achieve high-level expression of soluble recombinant human interferon alpha (rhIFNalpha) in E. coli, we have first constructed a recombinant expression plasmid (pGEX-hIFNalpha2b), in which we merged the hIFNalpha2b cDNA with the glutathione S-transferase (GST) coding sequence downstream of the tac-inducible promoter. Using this plasmid, we have achieved 70% expression of soluble rhIFNalpha2b as a GST fusion protein using E. coli BL21 strain, under optimized environmental factors such as culture growth temperature and inducer (IPTG) concentration. However, release of the IFN moiety from the fusion protein by thrombin digestion was not optimal. Therefore, we have engineered the expression cassette to optimize the amino acid sequence at the GST-IFN junction and to introduce E. coli preferred codon within the thrombin cleavage site. We have used the engineered plasmid (pGEX-Delta-hIFNalpha2b) and the modified E. coli trxB(-)/gor(-) (Origami) strain to overcome the problem of removing the GST moiety while expressing soluble rhIFNalpha2b. Our results show the production of soluble and functional rhIFNalpha2b at a yield of 100 mg/l, without optimization of any step of the process. The specific biological activity of the purified soluble rhIFNalpha2b was equal to 2.0 x 10(8) IU/mg when compared with the WHO IFNalpha standard. Our data are the first to show that high yield production of soluble and functional rhIFNalpha2b tagged with GST can be achieved in E. coli.     

表达MAGE-1/HSP70/MAGE-3工程菌的稳定性

目的检测重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状的稳定性。方法将工程菌菌株连续传50代,每隔10代挑取单克隆菌落进行诱导表达,并计算质粒丢失率。提取不同代次的质粒,扫描电镜观察,检测融合蛋白表达水平,并进行工程菌的染色镜检及生化鉴定。结果pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)融合蛋白工程菌呈典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义。结论重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状稳定,可作为生产用菌种。     

重组质粒DNA D-GPEi工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组质粒D-GPEi工程菌发酵工艺条件。方法控制相关发酵参数,观察溶解氧浓度、比生长速率和培养时间对工程菌生长和质粒浓度的影响。结果发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%~50%。补料前比生长速率为0.5~0.7/h,6 h开始补料,比生长速率下降,12 h后比生长速率为0.1~0.2/h。连续发酵3批工程菌,21 h后收集菌体,得到菌体平均产量为89.4 g/L(A=52.6),质粒平均产量为359.8 mg/L。3批工程菌浓度和质粒拷贝数差异无显著意义。结论此发酵工艺得到工程菌浓度和质粒拷贝数较高,重复性好,适用于大规模工业化生产。     

Toxicity-based selection of Escherichia coli mutants for functional recombinant protein production: application to an antibody fragment

We propose a novel approach to the selection of Escherichia coli bacterial strains improved for the production of recombinant functional proteins. This approach is based on aggregation-induced toxicity of recombinant proteins. We show that selection of clones displaying a reduced toxicity is an efficient means of isolating bacteria producing recombinant protein with reduced aggregation in favour of correct folding. For an efficient selection, we found that time of toxicity induction must be precisely determined and recombinant protein must be expressed as a fusion with a protein whose activity is easily detectable on plates, thus allowing elimination of non-productive mutants. Choosing the expression to the periplasmic space of an scFv fragment fused to the N-terminus of alkaline phosphatase as a model, we selected chromosomal mutations that reduce aggregation-induced toxicity and showed that they concomitantly improve production of a functional recombinant hybrid. The effects of the mutations isolated could then be cumulated with those of other strategies used for recombinant scFv production. Thus, we could ensure a 6- to 16-fold increase in production of a functional scFv-PhoA hybrid. This is the first report demonstrating the possibility of directly selecting on agar plates E.coli strains improved for functional recombinant protein production from a large bacterial mutant library.     

大肠杆菌生产琥珀酸的代谢工程研究进展

琥珀酸是一种重要的化工原料,具有广阔的市场. 微生物发酵法生产琥珀酸可以解决常规化学合成法对石油的依赖. 代谢工程的兴起使重组大肠杆菌生产琥珀酸变为可能,也取得了一定的成效,但是其发酵强度还不够高,且过程中伴随着其他有机酸的积累,因此还不适于工业化生产. 代谢工程以系统生物学为基础,为重组大肠杆菌的进一步改造提供了更合理的依据. 本工作以大肠杆菌生产琥珀酸所涉及的关键酶、代谢途径及其改造为对象,系统综述了大肠杆菌生产琥珀酸所涉及的代谢工程技术及其最新研究进展,并探讨了将来的发展前景.