XinanI 介导的草甘膦高抗转基因水稻的研究

通过农杆菌介导的转化方法,将携带草甘膦抗性基因 xinanI 的农杆菌分别侵染粳稻品种豫农粳与方欣4号愈伤组织,通过2轮2 mmol/L 草甘膦筛选获得抗性愈伤组织,再经过诱导和分化得到了转基因水稻幼苗.对转基因幼苗进行 xinanI 基因特异性 PCR 分析和草甘膦抗性筛选,结果表明,豫农粳与方欣4号抗性愈伤组织分化的幼苗的 PCR 阳性率分别是75.1%和72.0%,草甘膦抗性筛选阳性率分别为52.7%和49.4%.进一步对转基因植株进行抗性分析表明,草甘膦抗性基因 xinanI 在水稻中可以高效表达,并赋予水稻高水平草甘膦抗性,T0代转基因植株经1.6%草甘膦溶液处理后仍然可以正常生长发育.     

人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)基因在马铃薯中的表达

目的　构建转基因马铃薯植株 ,以便大规模生产人铜锌超氧化物歧化酶 (hCu ,Zn SOD)。方法　采用RT PCR技术从人肝总RNA中分离扩增了hCu Zn SOD基因 ,并将其重组到植物表达载体pPSCuSOD中 ,用三亲交配法将重组质粒pPSCuSOD转化到农杆菌LBA44 0 4,再用农杆菌介导转化马铃薯。结果　经PCR和PCR Southern分析证明hCu Zn SOD基因已整合到马铃薯基因组中。Westernblot分析证明 ,hCu Zn SOD基因已在马铃薯植株中得到表达。NBT光还原法检测转基因马铃薯块茎中的SOD总酶活性为 192 0U g .FW。结论　已成功地构建了转基因马铃薯植株     

转基因枸杞表达重组HIV壳体蛋白的鉴定

目的构建转基因枸杞表达系统,并表达HIV壳体蛋白。方法以重组质粒pET-3a-MA4-CA为模板,PCR扩增MA4-CA基因,克隆至pGEM-T质粒中,转化DH5α,经双酶切后重组于pCAMBIA1305.2载体中,构成pCAMBIA1305.2-MA4-CA载体,经农杆菌介导叶盘转化法转化枸杞,培育转基因枸杞植株,进行芽、根诱导。结果在植物培养箱中,转基因植株成功地进行了分化及生根的诱导。PCR扩增分析表明转基因植株内存在目的基因,并与启动子p35S相连。ELISA及Westernblot实验证实在转基因枸杞叶子提取物中存在壳体蛋白。结论初步建立了表达具有免疫原性的HIV壳体蛋白的转基因枸杞表达系统。     

表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株的建立

目的建立表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。方法采用PCR方法分别扩增HBsAg及rhIFNα2b基因,以GS linker连接后,克隆入表达质粒pBI121,构建植物细胞表达质粒pBISI,转化农杆菌LBA4404,感染人参愈伤组织细胞。经G418筛选抗性细胞株,提取细胞基因组DNA,进行PCR检测;应用ELISA法检测HBsAg及rhIFNα2b的表达;通过Western blot分析表达蛋白的反应原性。结果重组表达质粒pBISI经酶切鉴定,表明构建正确。筛选得到3株正常生长的人参细胞株,基因组DNA扩增得到约1200bp的融合基因片段;经ELISA检测,其中1株能够表达HBsAg及rhIFNα2b;表达的蛋白与鼠抗HBsAg血清在相对分子质量35000处出现特异条带。结论已获得了表达HBsAg及rhIFNα2b融合蛋白的人参细胞株。     

蓖麻愈伤组织对铜的抗性研究

为了探讨蓖麻愈伤组织对铜的抗性．研究了铜胁迫下蓖麻愈伤组织的增长及其铜吸收作用。结果显示,铜浓度为60mg·L^-1时,愈伤组织的增长受到抑制,抗性指数仅为33．87％;铜浓度为40mg·L^-1时,愈伤组织呈淡黄色,生长较快,抗性指数达到61．29％,并且这种抗性可以保持至连续继代培养6周之后。培养至第4周,铜浓度（mg·L^-1）为10、20、30、40各处理的抗性指数都高于第3周．各处理愈伤组织铜含量（mg·g^-1）依次为0．33、0．54、1．16、1．40。培养基铜浓度为40mg·L^-1。可作为筛选铜抗性蓖麻愈伤组织的临界值。     

对番茄潜叶蛾具有抗性的Cry1Ac基因

正番茄潜叶蛾(Tuta absoluta)是危害番茄的重要害虫,化学防治难度较大。有土耳其的研究人员利用根癌农杆菌介导转化系统将一个修饰的Bt基因Cry1Ac导入番茄体内,共生成了4个表达Cry1Ac转基因的品系。番茄Cry1Ac蛋白的表达引起番茄潜叶蛾死亡率达38%~100%。此外还发现半合子基因即可赋予番茄对潜叶蛾产生抗性。该研究可为抗潜叶蛾转基因番茄品种     

表达人胰岛素的人参愈伤组织细胞系的建立

目的建立表达人胰岛素的人参愈伤组织细胞系。方法将已构建成的植物表达载体pBI121/(CTB-BA)转入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌与人参愈伤组织细胞的共培养,将人胰岛素基因整合到人参愈伤组织细胞中,对其表达产物进行检测,并用小鼠进行降糖试验。结果表达产物的基因组DNA测序结果与设计完全相同。Westernblot检测显示,在相对分子质量约17000处有特异蛋白反应带。ELISA法检测人胰岛素表达量为5.31μIU/ml。小鼠降糖试验表明人参愈伤组织细胞有降血糖的作用,而转化的人参愈伤组织细胞降血糖作用更明显。结论人胰岛素已在人参愈伤组织细胞中成功表达。     

光温条件对新疆雪莲愈伤组织反应器培养后再分化能力的影响

研究了光质、光周期、昼夜温差和低温处理时间对反应器大规模培养后的新疆雪莲愈伤组织再分化能力的影响. 实验结果表明,长波长光更有利于愈伤组织的再分化. 光照时间显著影响愈伤组织的再分化能力,光照时间为16 h/d时愈伤组织的分化频率和平均出芽数达到最大,分别为76.7%和1.8个/块. 昼夜温差与愈伤组织的再分化能力呈显著负相关. 与水母雪莲不同,低温处理并不利于新疆雪莲愈伤组织的再分化. 新疆雪莲愈伤组织的再分化能力与同工酶的种类和活性密切相关.     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达

目的提高乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在人参愈伤组织细胞中的表达。方法构建一种植物细胞表达载体pBIBeo,该载体携带CaMV 35S双增强启动子和TMV(U1株)翻译增强子。用pBIBeo转化的农杆菌LBA4404与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞团PBIBeo,连续继代培养选育出用于植物源口服乙肝疫苗生产的高产细胞株。提取基因组DNA和mRNA,进行PCR和RT-PCR鉴定,Western blot鉴定HBsAg的特异性,电镜下观察纯化抗原颗粒大小,并以ELISA检测HBsAg的表达水平。结果转化的人参细胞基因组DNA进行PCR反应,得到约700 bp的启动子基因片段。提取mRNA进行RT-PCR反应,得到约700 bp的HBsAg基因片段。Western blot分析可见相对分子质量为24 000的特异性条带。亲和层析纯化细胞表达的HBsAg抗原,电镜观察可见平均直径为32 nm的颗粒。ELISA检测结果表明pBIBeo转化细胞株HBsAg表达量比pBIBSa转化细胞株提高1~2倍。结论人参细胞基因组已经整合了目的基因并稳定高效表达。     

表达乙肝病毒表面抗原人参细胞系统的建立

目的建立乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞表达系统。方法构建含有HBsAg基因的植物细胞表达载体质粒pBIBSb。采用农杆菌感染人参细胞的方法,经农杆菌培养、农杆菌与受体细胞共培养、受体细胞的脱菌培养以及转化体细胞的选择培养后,筛选在G418抗生素培养基上正常生长的细胞株。应用ELISA方法检测抗性细胞株的HBsAg表达;提取基因组DNA进行PCR扩增反应。结果质粒pBIBSb的酶切结果正确。经G418抗生素筛选得到8株正常生长的细胞株,其中5株能够表达HBsAg,提取基因组DNA进行PCR扩增反应,得到大小约700 bp的扩增片段。结论获得了整合HBsAg基因,并能够稳定表达HBsAg的人参细胞表达系统。     

对番茄害虫有控制作用的细菌毒素

嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophila）是病原细菌,能分泌XnGroEL蛋白。棉铃虫取食此杀虫蛋白后,幼虫的生长、发育停止。印度Jawaharlal Nehru大学的Punam Kumari和其同事通过农杆菌介导转化开发了表达此蛋白的番茄。不同的分析证实XnGroEl蛋白在番茄体内基因的编码和表达。转基因番茄能健康地生长。生测试验表明：与非转基因番茄相比,此转基因番茄能完全防治幼虫,55%~77%减少植物的损失。因此,XnGroEl是一个新颖的有潜力可使植物对棉铃虫具有抗性的蛋白质。     

根癌农杆菌介导透明颤茵血红蛋白基因(vgb)在短密青霉菌中的克隆表达

利用根癌农杆菌LBA4404介导,将编码透明颤菌血红蛋白的结构基因(Vitreoscilla Hemoglobin gene,vgb)导入到短密青霉ATCC16024中,用于改善菌体对氧的摄取能力,提高霉酚酸(Myhophenoilc Acid,MPA)的发酵水平,降低生产成本。通过潮霉素抗性筛选、PCR分子鉴定和MPA发酵验证等结果表明,vgb基因在短密青霉中成功获得了表达;vgb基因的表达提高了短密青霉的菌体密度,转化子MPA产量达到2.18 g·L?1,比原始菌株提高了27.5%。     

光质对玛咖愈伤组织生长、分化的影响

研究了在组织培养过程中光质对玛咖愈伤组织生长、分化及细胞内糖代谢关键酶的影响. 在红光、黄光和白光下培养25 d, 玛咖愈伤组织的干重明显高于在绿光和蓝光下. 在分化培养基上,红光、黄光和白光条件下玛咖愈伤组织的出芽率达78%~82%,而在绿光和蓝光下出芽率几乎为0. 进一步研究表明,红光、黄光和白光条件下糖代谢中3种关键酶(葡萄糖-6-磷酸酶、己糖激酶、苹果酸脱氢酶)的活性明显高于绿光和蓝光条件下,与愈伤组织生长、分化情况相关联,说明细胞内的糖代谢受光质调节并参与了对愈伤组织生长和分化的调节.     

细梗蔷薇愈伤组织提取物在人真皮成纤维细胞及3D表皮模型上的护肤功效探究

通过植物组织培养技术得到细梗蔷薇（Rosa graciliflora）愈伤组织，利用纯水超声提取和真空冷冻干燥工艺获得细梗蔷薇愈伤组织提取物（RCE），然后对RCE进行成分检测和体外护肤功效评估。结果表明，RCE含有氨基酸、维生素、有机酸和多酚等多种活性成分。体外护肤检测结果表明，RCE对人真皮成纤维细胞有一定的增殖作用，0.01%和0.05%RCE能促进人真皮成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白，与空白对照对比，其Ⅰ型胶原蛋白分别提高83%和79%，作用效果和阳性对照维生素C相似。此外，在重建的3D表皮模型上，0.01%RCE能够显著促进细胞增殖活性标记物Ki67、皮肤屏障功能标志物丝聚蛋白（Filaggrin）及外膜蛋白（Involucrin）的表达，相比空白对照，其阳性率分别提高308%,853%和349%，具有显著差异性。研究发现RCE具有潜在的延缓皮肤衰老和提高皮肤屏障功能的作用，有望作为一种绿色原料添加在化妆品中使用。     

肉苁蓉愈伤组织的超低温保藏方法

提出了一个优化的简单的超低温保藏方法,成功地运用于肉苁蓉愈伤组织的低温保藏. 为了获得最佳的实验结果,肉苁蓉愈伤组织首先在添加了6%二甲亚砜的B5培养基中进行预培养,然后用玻璃化保护剂在25℃处理20 min,最后投入液氮中进行冷冻. 玻璃化保护剂的成分为30%(j)甘油+15%(j)乙二醇+10%(j)二甲亚砜+0.5 mol/L蔗糖. 冷冻后的愈伤组织在30℃的水浴中迅速解冻,接着用25℃的1.0 mol/L蔗糖溶液洗净愈伤组织上附着的玻璃化保护剂,最后在B5培养基上对愈伤组织进行恢复性培养. 经过上述冻存处理的肉苁蓉愈伤组织存活率可达86％. 恢复培养5个月后,愈伤组织中苯乙醇糖甙类化合物的含量和产量分别达到冷冻前的97%和95%.     

IRX1基因在肝癌中的表达及其临床意义

目的探讨易洛魁家族同源盒基因IRX1(Iroquois homebox gene)在肝癌中的表达及其临床意义。方法收集82份肝癌组织(高分化26份,Edmondson分级Ⅰ级;中分化25份,Edmondson分级Ⅰ-Ⅱ和Ⅱ级;低分化31份,Edmondson分级Ⅱ-Ⅲ和Ⅲ级)和11份正常或良性疾病非癌组织标本,采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)和Western blot检测各组肝脏组织中IRX1的表达,免疫组织化学法检测IRX1在肝脏组织中的定位及临床特征。结果肝癌组织中IRX1基因和蛋白的表达均明显高于非癌对照组(P<0.05),且其表达量与肿瘤的分化程度相关,肿瘤分化程度越低,其表达量越高(P<0.05)。IRX1在肝癌组织中的阳性表达率明显高于非癌对照组(P<0.05),且伴随着肿瘤分期增加和分化程度的降低,IRX1阳性率越高,但IRX1阳性率与HBV感染以及伴随肝硬化情况无明显相关性(P>0.05)。IRX1染色阳性的高分化肝癌组织中,68.2%定位于细胞质,18.2%定位于细胞核,13.6%胞质和胞核均阳性;IRX1染色阳性的低分化肝癌组织中,胞质胞核均阳性的增加至65.5%。结论IRX1可能参与调控肝癌的发生发展过程,IRX1的表达与肝癌的分化程度有关,提示IRX1可作为判断肝癌预后、分化程度以及肿瘤靶向分子治疗的指标。     

实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻重链基因的拷贝数

目的建立实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻重链基因的拷贝数。方法以分别带有抗体轻链和重链的质粒作为标准品,进行实时定量PCR反应,建立标准曲线。提取转染抗体轻重链基因的CHO细胞基因组DNA,进行定量PCR反应,通过标准曲线,再根据10 ng CHO基因组中含有的单拷贝基因的数量,分别计算得到抗体的轻链和重链基因在CHO细胞中的拷贝数。结果分别建立了抗体轻链和重链基因的拷贝数标准曲线,标准曲线的相关系数均在0.99以上,PCR扩增效率分别为91.6%和91.8%,具有良好的特异性。随着细胞培养代次的增加,轻链基因和重链基因的拷贝数均出现降低的现象。结论成功建立了实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻链和重链基因的拷贝数,可用于外源抗体基因在CHO细胞中的遗传稳定性研究,也为高表达细胞株的获得提供了一种检测方法。     

藏红花胚性愈伤组织的发生及其调控

为提高藏红花胚性愈伤组织的繁殖系数和出芽率,促进其生长和分化,以建立藏红花离体快繁体系,解决藏红花资源短缺问题,研究了藏红花胚性愈伤组织的发生及其调控. 结果表明,获得的藏红花球茎1细胞系具有良好的胚性愈伤组织发生能力. 胚性愈伤组织生长的优化条件为：在添加3.0 mg/L 6-BA, 0.25 mg/L NAA和400 mg/L CH的B5固体培养基上,22℃下全时暗培养25 d,繁殖系数达到9 g/g. 胚性愈伤组织出芽的优化条件为：在添加3.0 mg/L 6-BA, 0.25 mg/L NAA和400 mg/L CH的1/2 B5固体培养基上,在22℃及光照强度31.74 mmol/(m2×s)条件下,每天光照10 h,暗培养14 h,培养45 d出芽率达到44.7%,高于国外报道的20%.     

利用强启动子对纤维二糖酶基因在里氏木霉中进行异源表达

为提高里氏木霉中纤维二糖酶的表达量,构建了含有不同强启动子的纤维二糖酶基因重组质粒,以根癌农杆菌介导的方法将表达元件整合到里氏木霉基因组中,获得了高效表达纤维二糖酶基因的里氏木霉优势菌株。采用反转录的方法从黑曲霉RNA中克隆得到纤维二糖酶基因(cb)的编码序列,并以启动子Pcbh1和Pxyn1控制cb基因的表达,通过根癌农杆菌介导转化,成功将表达元件整合到里氏木霉基因组中。通过对不同启动子控制下的阳性转化子进行发酵筛选,纤维二糖酶活性最高比对照分别提高了376%和323%。通过水解纤维素实验,重组菌株表达的纤维素酶能更好的对纤维素进行水解,水解率比对照菌株分别高出了29.73%和26.78%。该研究成果对解决里氏木霉表达纤维二糖酶低的问题具有一定的指导意义。     

2基因片段的克隆和反义表达载体的构建及遗传转化初步研究

以我国重要的生物能源灌木——中间锦鸡儿枝叶和种子为材料,根据Genbank中已经发表fad2基因的同源序列,利用PCR技术克隆得到两个基因片段.在GenBank中Blast(GenBank登录号AY957393和AY957394),所得基因片段和同属豆科的Glycine max Gm fad2-2a,同源性高达88 %,属于fad2基因编码区中间片断.将所得片段经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建了反义表达载体pBI121 fad2,并利用农杆菌介导法转入烟草叶片,获得了抗卡那霉素和安苄青霉素的再生烟草植株.初步分析结果表明,与对照烟草相比较,转基因烟草种子脂肪酸含量没有明显差异,而亚油酸则减少了10.3 %.这为进行下一步柠条分子改良,获得高单不饱和脂肪酸的优质中间锦鸡儿新品种以及改造其它木本生物柴油用木本原料植物奠定了基础.