重组人BAFF_(134～285)的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的克隆人TNF家族的B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区cDNA,并进行高效表达和纯化。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RTPCR扩增编码人BAFF胞外区134～285氨基酸残基cDNA,经序列测定后,克隆至pQE80L载体中,并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达及Ni2+NTA柱层析纯化目的蛋白,最后经SDSPAGE和Westernblot检测。结果RTPCR扩增得到了459bp的cDNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF134～285的cDNA序列一致,SDSPAGE及Westernblot证实表达蛋白确实为6×HisBAFF134～285融合蛋白,并存在于包涵体中。结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF134285,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

人sΔBAFF的高效原核表达及纯化

目的克隆TNF家族B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区134~285(sBAFF134-285)氨基酸残基段缺失突变体(sΔBAFF)的cDNA,并进行表达及纯化。方法以构建的重组质粒pUC19/sBAFF为模板,采用一步反向PCR法,扩增缺失编码sBAFF的142~160位氨基酸的核苷酸序列。经测序证实后,克隆入原核表达载体pQE-80L。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot检测表达产物,Ni2+-NTA柱层析纯化目的蛋白。结果经一步反向PCR扩增后得到401bp的DNA片段,该片段序列与GenBank报道的编码人ΔBAFF的胞外区(sΔBAFF)cDNA序列一致。含sΔBAFF的表达载体在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为18000的蛋白质并以包涵体的形式存在,经Ni2+-NTA柱层析纯化后得到高纯度的目的蛋白。结论已成功地制备出人sΔBAFF蛋白,为其功能的研究创造了条件。     

人s△BAFF的高效原核表达及纯化

目的克隆TNF家族B细胞激活因子（B cell activating factor to the TNF family,BAFF）胞外区134～285（sBAFF134-285）氨基酸残基段缺失突变体（s△BAFF）的cDNA,并进行表达及纯化.方法以构建的重组质粒pUC19/sBAFF为模板,采用一步反向PCR法,扩增缺失编码sBAFF的142～160位氨基酸的核苷酸序列.经测序证实后,克隆入原核表达载体pQE-80L.经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,Ni2＋-NTA柱层析纯化目的蛋白.结果经一步反向PCR扩增后得到401 bp的DNA片段,该片段序列与GenBank报道的编码人△BAFF的胞外区（s△BAFF）cDNA序列一致.含s△BAFF的表达载体在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为18 000的蛋白质并以包涵体的形式存在,经Ni2＋-NTA柱层析纯化后得到高纯度的目的蛋白.结论已成功地制备出人s△BAFF蛋白,为其功能的研究创造了条件.     

4-1BBL胞外区cDNA的克隆及鉴定

目的 研究共刺激分子4-1BBL对T淋巴细胞的作用,并进一步研究肿瘤的免疫治疗。方法 按照4-1BBL的基因序列,设计合成了可扩增4-1BBL胞外区的引物序列,用RT-PCR方法从急性B淋巴白血病Raji细胞系细胞中提取总RNA,扩增出4-1BBL胞外区片段,并克隆到载体中,经酶切鉴定后再进行序列分析。结果 所克隆的目的片段经EcoRI和XhoI双酶切和序列分析证明正确。结论 已成功地钓取4-1BBL胞外区基因并克隆到pMD-18载体上。     

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大肠杆菌中的表达及鉴定

采用RT－PCR技术从LPS诱导的人外周血单核细胞中扩增出人粒细胞集落刺激因子cDNA,将编码成熟序列的cDNA在保证编码氨基酸不变前提下突变并插入到PR启动子下游,使rhG-CSF在大肠杆菌中获得表达。表达产物为包涵体,占菌体总蛋白量的21．4％。纯化产物的比活性可达1．0×108u／mg。     

人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

人血管内皮生长因子受体FLT-1胞外区1-3环cDNA的表达、纯化及鉴定

目的　研究人血管内皮生长因子受体FLT 1胞外区 1 3环cDNA在酵母菌中的表达、纯化及生物学活性。方法　将编码 316个氨基酸残基的人FLT 1胞外区 1 3环cDNA插入到含AOX1启动子和d分泌信号肽序列的Pichiapastoris酵母载体中 ,构建了重组表达质粒pPICqk/FLT l(1～ 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Mut表型转化子 ,经摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。结果　经SDS -PAGE显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4天的表达量达到培养上清总蛋白的 6 0 % ,径Westernblot检测抗原性及特异性良好 ,经CM SepharoseFF阳离子交换层析和Sephacryls 10 0分子筛层析 ,纯度达 90 %以上 ;经生物活性检测具有结合hVEGF16 5的能力和hVEGF16 5促进HUVEC的增殖功能。结论　人血管内皮生长因子受体FLT 1胞外区 1～ 3环cDNA在酵母菌中表达成功。     

小鼠B淋巴细胞活化刺激因子可溶性片段在毕赤酵母中的表达、纯化及其生物学活性的初步鉴定

目的在毕赤酵母中表达小鼠B淋巴细胞活化刺激因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)可溶性片段(msBAFF),纯化后检测其生物学活性。方法采用RT-PCR法从BALB/c小鼠外周血单核细胞中扩增msBAFF基因,插入表达载体pPICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA-msBAFF,转化巴斯德毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达的重组msBAFF蛋白经硫酸铵沉淀及Q Sepharose XL阴离子交换柱纯化后,分别单独及与anti-IgM共同作用于BALB/c小鼠脾脏B淋巴细胞,检测其对B淋巴细胞活力的影响。结果重组表达质粒pPICZαA-msBAFF经双酶切鉴定构建正确;表达的重组msBAFF蛋白相对分子质量约为20 000,诱导60 h表达量较高;经硫酸铵沉淀、透析除盐及Q Sepharose XL阴离子交换柱纯化,获得了较纯的msBAFF,BCA法测定纯化蛋白的产率为20 mg/L;重组BAFF蛋白具有促进小鼠B淋巴细胞活力的作用。结论成功在毕赤酵母中表达了重组msBAFF蛋白,纯化的重组蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究小鼠BAFF基因的功能及基于BAFF的佐剂与单克隆抗体的制备奠定了物质基础。     

鼠TNF家族的B细胞活化因子ORF基因的克隆及原核表达

目的克隆鼠TNF家族的B细胞活化因子(Bcell activating factor of TNF family,BAFF)ORF基因,并进行原核表达及纯化。方法提取鼠新鲜脾脏组织总RNA,经RT-PCR扩增BAFF ORF基因,测序后,克隆入载体pMAL-c2x,构建重组表达质粒pMAL-c2x/BAFF ORF,转化大肠杆菌Rosseta(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果 RT-PCR扩增得到约930bp的cDNA,其序列与GenBank中登录的鼠BAFF ORF cDNA序列的同源性达99.9%;重组表达质粒pMAL-c2x/BAFF ORF经酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为76500,IPTG终浓度为0.9mmol/L,诱导时间为4h,目的蛋白的表达量最高,破菌上清和沉淀中均可见目的蛋白条带,可溶性蛋白的表达量占全菌总蛋白的49%;纯化的重组蛋白纯度可达90%,含量为0.9mg/ml,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了鼠BAFF ORF基因,并进行了原核表达及纯化,为进一步研究其生物功能奠定了基础。     

中国人MBL基因编码区的克隆与原核表达

目的克隆中国人MBL基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法提取肝总RNA,RT-PCR扩增MBL编码区序列,并克隆到pGEM-T-easy载体上,再亚克隆到pET-30(a)上。诱导表达重组MBL,并通过SDS-PAGE检测表达情况,表达蛋白经初步纯化后,用ELISA及点杂交试验检测其免疫原性。结果克隆得到长747bp的MBL编码区序列,与GenBank中的MBL序列同源性在99%以上。重组MBL相对分子质量约为36000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白量的20%左右,表达蛋白经初步纯化,纯度可达95%以上。ELISA检测显示重组MBLA490值与阴性对照差异有显著意义(10倍以上),点杂交检测结果为阳性。结论已成功克隆中国人MBL基因的编码区序列,并在大肠杆菌中表达,表达产物与天然MBL具有相似的免疫原性。     

人β-NGF蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子β(β-NGF)蛋白,并进行纯化及生物活性检测。方法以人外周血基因组DNA为模板,PCR扩增人β-NGF基因片段,克隆并测序后,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-β-NGF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用分子筛层析法对表达产物进行纯化,复性后用鸡胚背根神经节培养试验检测其生物活性。结果酶切和测序证实,PCR扩增的人β-NGF基因片段为β-NGF成熟肽编码序列;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的23.5%,主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,表达量为4.8mg/L菌液,且可明显促进鸡胚背根神经节神经突起生长。结论已在大肠杆菌中成功表达了人β-NGF蛋白,纯化后的重组蛋白具有良好的生物活性。     

人肝细胞生长因子β链在E.coli中的表达、纯化及活性测定

目的 为获得重组人肝细胞生长因子β(rhHGF-β)的高效表达体系,分离纯化rhHGF-β,以期研究其在生物学和医学中的作用。方法 从人胎肝组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术,对HGF-β基因加工修饰,与载体PBV220重组,构建rhHGF-β的表达载体,转化大肠杆菌,筛选rhHGF-β的高效表达菌株。对rhHGF-β进行粗纯化,透析复性后MTT法检测生物活性。结果 获得了rhHGF-β完整的cDNA序列,重组克隆的酶切结果与设计一致。目的 蛋白的表达量占全菌蛋白的30％,粗纯化后纯度达90％,复性产物能刺激大鼠肝细胞的增殖。结论 建立了rhHGF-β的表达体系,获得了具有生物活性的rhHGF-β,为进一步大量制备和研究HGF的生物学功能提供了重要的实验数据。     

人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因的克隆及原核表达

目的克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化。结果从SK-Br3细胞系中扩增出387bp的人HER2胞外近膜区基因;重组表达质粒pET41d/HER2构建正确;IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高;纯化后重组蛋白浓度为1.5mg/ml。结论已成功表达了HER2胞外近膜区蛋白,为抗HER2单克隆抗体的制备提供了抗原。     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段的基因克隆和原核表达

目的克隆人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段并构建其原核表达系统。方法用PCR法从人巨细胞病毒AD169株基因组DNA中扩增gB/AD-1片段并克隆至pGEM-T载体,酶切后,亚克隆至表达载体pET-15b,构建重组表达质粒pET-15b/gB/AD-1,并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析一步纯化,并用Westernblot鉴定。结果gB/AD-1蛋白表达量达到35%。表达产物经纯化后,纯度大于95%。经Westernblot检测,表达产物与CMV阳性人血清发生特异性反应。结论已成功构建重组表达载体pET-15b/gB/AD-1,并在大肠杆菌中高水平表达gB/AD-1。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中表达及在tPA纯化中的应用

目的构建刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体(rserETI)原核表达载体,制备表达产物,用于tPA的纯化。方法设计合成rserETI编码序列DNA片段,以PCR法扩增出全长编码区序列,经酶切后克隆至pET9a表达载体,转化大肠杆菌JM109DE3,以IPTG诱导表达。表达产物经变性、复性、QFF层析纯化后,测定其活性,并与溴化氰活化的Sepharose偶联合成亲和层析柱,纯化rtPA。结果rserETI的表达量约占大肠杆菌菌体总蛋白的30%,复性率为80%,经QFF层析纯化后,蛋白浓度为1.58mg/ml,SDS-PAGE检测显示无杂蛋白污染,纯度大于95%,对rtPA突变体的抑制比活性为4×104IU/mg。偶联合成的rserETI-Sepharose亲和层析柱能特异性地纯化rtPA,rtPA突变体纯度达96%,比活性为5.07×105IU/mg。结论已成功构建了rserETI原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,制备的表达产物可用于rtPA的纯化。