热休克诱导表达的HSP70对X射线诱发淋巴细胞凋亡的影响

Ficoll法分离大鼠外周血淋巴细胞,于42℃、5％CO2培养箱中热休克处理90mill,采用流式细胞仪检测热休克预处理后恢复不同时间的淋巴细胞中HSP70的表达情况;采用流式细胞术AnnexinV／PI双标法检测经过热休克预处理的淋巴细胞经0．5Gy、1．0Gy、1．5Gy、2．0Gy、2．5Gy、3．0GyX射线辐照后细胞凋亡率的变化。以探讨热休克预处理后淋巴细胞中HSP70的表达情况和HSP70对X射线辐照后淋巴细胞凋亡率的影响。结果显示：1．淋巴细胞经热休克预处理后恢复1h,HSP70表达即有明显增加,4h达到高峰,可持续表达24h。2．热休克预处理诱导表达的HSP70可以抵抗X射线（1．0～3．0Gy）诱导的淋巴细胞凋亡。由此本工作可以得出结论,热休克预处理表达的HSP70可抵抗X射线诱发的淋巴细胞凋亡。     

辐射对大鼠淋巴细胞电泳率的影响

本文叙述了经γ射线照射后大鼠淋巴细胞电泳率的变化。采用细胞电泳装置,于25±0.5℃下测量细胞电泳率,观察了经~(60)Coγ射线照射后淋巴细胞电泳率随时间的变化,以及照射后4小时所测电泳率的降低与照射量之间的关系。实验结果指出,淋巴细胞电泳率随照后时间而逐渐降低,于照后4小时达最低值,然后开始恢复,淋巴细胞电泳率随照射量的增加呈指数下降。     

60Co γ射线照射对培养小鼠骨髓基质细胞IL-6表达的影响及机制研究

观察了^60Coγ射线照射对培养小鼠骨髓基质细胞（BMSCs)的白细胞介素－6（IL－6）mRNA及蛋白表达的影响。采用Dexter方法体外培养小鼠BMSCs,8.0Gy^60Coγ射线照射后用放射免疫法测定培养上清液中IL－6的浓度,应用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）的方法检测IL－6的mRNA表达,同时与NF－KB抑制剂PDTC或地塞米松预处理的BMSCs相比较。结果表明,培养小鼠BMSCs在正常情况下低表达IL－6,辐射后2h时其mRNA水平表达升高,4h时达峰值,之后开始下降;其蛋白表达在2h时开始升高,8－12h时达峰值,24h时基本恢复正至正常水平;而BMSCs在受照射前2h用PDTC或地塞米松预处理后,辐射并不引起IL－6mRNA表达的改变。结果显示,^60Coγ射线照射能够激活培养小鼠BMSCs细胞IL－6基因的转录,使细胞分泌IL－6增多,其机制可能与照射引起的NF－KB活化有关。     

^60Coγ射线诱导HL-7702细胞子代蛋白质表达的改变

利用双向凝胶电泳（2-DE）和质谱技术,采用不同剂量60Coγ射线照射人正常肝细胞系HL-7702细胞,观察比较受照细胞克隆子代2-DE图谱的变化,并对差异蛋白质进行鉴定。结果表明,受照肝细胞克隆子代蛋白质表达发生了改变,串联质谱测序和串联质谱数据的Mascot共鉴定出17个差异表达的蛋白质点,4个是上调蛋白质,13个是下调蛋白质;上调蛋白质中,线粒体热休克蛋白60（HSP60）和珠蛋白转录因子1（GATA-1）明显高表达;免疫印迹技术进一步证实HSP60和GATA-1的表达随照射剂量的增加而增强。结果提示,在辐射诱发基因组不稳定性过程中,HSP60和GATA-1蛋白质可能发挥着作用。     

辐射致人正常肝细胞蛋白质组电泳图谱的改变

利用蛋白质组学技术对0.5和2Gyγ射线照射后4小时人正常肝细胞的蛋白质的变化进行了初步探讨。研究结果表明:与对照组相比,0.5Gy处理组中,照射后4h差异蛋白点数为146个,其中表达上调的蛋白67个,表达下调的蛋白79个;2Gy处理组中,照射后4h差异蛋白点数为127个,其中表达上调的蛋白83个,表达下调的蛋白44个。0.5Gy和2Gy处理组共同差异表达的蛋白点数56个,其中,表达上调的39个,表达下调的17个。肽质量指纹图谱分析结果显示共同表达的差异蛋白有热休克蛋白、胞内氯离子通道蛋白以及核磷蛋白等。     

不同剂量X射线照射对小鼠胸腺、脾脏、肝脏细胞凋亡及p53基因表达的影响

采用X射线全身照射小鼠,在普通光镜及流式细胞仪（FCM）下检测细胞凋亡,用免疫组织化学方法检测p53蛋白的表达。结果表明,照射剂量在2-8Gy范围内,脾脏、胸腺细胞凋亡率随照射剂量的增加而升高,细胞周期阻滞于G1期,凋亡率最高在照后8-12小时。肝脏细胞凋亡率最高峰出现在照后24小时,S期和G2／M期细胞阻滞增多。脾脏、胸腺细胞中p53蛋白表达阳性,肝脏细胞中p53蛋白表达阴性。     

Ku70对辐射诱导的BRCA1表达的影响

为探讨核蛋白Ku70对经γ射线照射后乳腺癌易感基因BRCA1表达的影响,本研究通过靶向升高或降低Ku70,观察了Ku70基因对BRCA1蛋白和mRNA表达水平的影响,以及Ku70对照射后SGC7901、EC109、H460 3种肿瘤细胞BRCA1表达的影响.结果表明:经siKu70处理的3种肿瘤细胞BRCA1的蛋白和m...     

~(137)Csγ射线累积照射SD大鼠后肝脏蛋白质组的分析

采用相对和绝对定量的同位素标签技术(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)分析累积受137Csγ射线照射大鼠肝脏组织的蛋白质表达,筛选出差异蛋白质,对差异表达的蛋白质进行GO注释分析及相互作用网络分析,探讨137Csγ射线累积照射对SD大鼠肝脏蛋白质的影响。结果显示,质谱数据经蛋白质数据库搜索,在3组样品中有定量信息的蛋白质有2 220个;0.2 Gy照射组与对照组相比,差异蛋白有149种,52种蛋白上调,97种蛋白下调;2 Gy照射组有243种差异蛋白,123种上调,120种下调;两组共同表达差异的蛋白有122种,其中,52种蛋白表达上调,70种蛋白表达下调;利用GO注释对122个共同差异蛋白质功能进行聚类分析,结果表明:根据分子功能注释,差异蛋白以酶催化、蛋白质结合、核酸结合等功能为主,另外少数蛋白还有翻译调控活性;根据细胞组成注释,多数蛋白参与细胞胞浆、细胞核、细胞膜的组成;根据生物学过程注释,多数蛋白参与代谢调节和生物过程调节。利用PAJEK软件对两个剂量组共同差异表达的蛋白进行相互作用网络分析。结果显示SF3B1、ATP6V1C1是蛋白相互作用网络的重要节点,这两个蛋白直接或间接地与其它差异蛋白存在相互作用。上述研究结果表明,137Csγ射线累积照射可诱导SD大鼠肝脏组织蛋白质组的改变,SF3B1、ATP6V1C1蛋白可能在累积照射的肝脏损伤机制中发挥作用。     

p53基因状态对人卵巢癌细胞辐射敏感性的影响

本研究应用PCR-SSCP银染法检测3株人卵巢癌细胞p53基因的存在状态,以四甲基偶唑蓝（MTT）染色法和流式细胞术（FCM）比较不同p53基因状态的肿瘤细胞在1～10Gy^60Coγ射线照射后的体外生长及凋亡率。结果显示,p53野生型的A2780细胞^60Coγ射线照射后发生明显的生长抑制和凋亡,而p53基因突变型的A2780-CP细胞和缺失型的SKOV3细胞则呈现较强的辐射抗性。本研究结果说明,人卵巢癌细胞的p53基因状态直接影响其对γ射线照射的敏感性。     

电离辐射对EL-4细胞的P53蛋白及其下游基因MDM2 mRNA和蛋白表达的影响

采用流式细胞术和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交检测了Ｘ射线照射后ＥＬ－４细胞中ｐ５３蛋白及其下游基因ＭＤＭ２ｍＲＮＡ和蛋白表达的变化,以探讨Ｘ射线照射诱导ＥＬ－４细胞Ｇ１期阻滞的分子机制。结果表明：经４ＧｙＸ射线照射后的ＥＬ－４细胞,ｐ５３蛋白表达在照射后２ｈ增高,４ｈ达峰值,持续至照射后２４ｈ（ｐ〈０．０５～０．００１）;ＭＤＭ２蛋白的表达在照射后４～２４ｈ明显升高（ｐ〈０．０５～０．０１）。进     

低聚壳聚糖对小鼠的辐射损伤防护作用探讨

探讨低聚壳聚糖对受γ射线照射小鼠辐射损伤防护作用。采用γ射线照射小鼠,检测骨髓有核细胞数、淋巴细胞凋亡数、脾脏脏器系数、细胞凋亡相关基因和P53蛋白、GADD45蛋白变化。流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测凋亡基因,Western blot方法检测蛋白表达。结果表明,与单纯照射组相比,低聚壳聚糖能提高受照小鼠的存活率;提高骨髓有核细胞数,降低骨髓淋巴细胞凋亡细胞数量;下调脾脏凋亡相关基因Bax、caspas-3,上调Bc1-2,Bcl-2/Bax比值升高;抑制P53蛋白、GADD45蛋白表达。结果提示,低聚壳聚糖可能通过抑制P53蛋白、GADD45蛋白表达,影响凋亡相关基因表达,抑制凋亡细胞的产生,促进造血功能恢复,从而起到保护受照损伤小鼠作用。     

辐射对小鼠骨髓基质细胞分泌血管内皮生长因子的影响

摘要为研究γ射线对小鼠骨髓基质细胞中血管内皮细胞生长因子（Vascular endothclia growth factor,VEGF）的影响,使用不同剂量（0、2．5、5、10Gy）的γ射线全身照射C57BL／6J小鼠。分别用逆转录多聚酶链反应（Reverse transfer polymcrasc chain reaction,RT-PCR）和酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbcnt assay,ELISA）法研究了照射后体外培养3、6、10d的骨髓基质细胞中mRNA和培养上清中的VEGF水平。结果发现,对非照射组,随着骨髓基质细胞体外培养时间的延长,其VEGF在基因和蛋白水平都显著升高。受到5Gy或10Gy射线照射后,VEGF随时间变化的总趋势与非照射组相同。在各时间点照射组的VEGF基因表达均高于同时点的非照射组。照射组培养6d上清液中VEGF含量高于同时点的非照射组;而在第10d时,却显著低于同时点的非照射组。分析其原因是因为受到照射后培养10d的骨髓基质细胞数已显著低于非照射同时点的细胞数,其培养上清中VEGF的减少与分泌VEGF的总细胞数减少有关。结果说明,5Gy或10Gy射线会引起骨髓基质细胞VEGF的表达增强。这一现象提示VEGF的表达升高可能是机体的一种代偿性反应,有利于机体造血的重建。辐射后,小鼠骨髓中VEGF的改变与骨髓基质的损伤、造血恢复的关系值得进一步研究。     

人成纤维细胞株辐射诱导凋亡与辐射敏感性相关性研究

为探讨不同放射敏感性人成纤维细胞株经辐射诱导后的凋亡情况,应用Ｔｕｎｅｌ法及流式细胞术（ＦＣＭ）检测细胞凋亡,以＾６０Ｃｏγ射线处理细胞。结果表明（１）＾６０Ｃｏγ射线照射后,集落形成实验表明,６号细胞株辐射敏感性高于８号细胞株。（２）Ｔｕｎｅｌ法和流式细胞术检测结果表明,凋亡率与辐射敏感性成正比,同样反映出６号细胞株辐射敏感性高于８号细胞株。（３）检测还发现,凋亡率与辐射剂量和辐射后时间成正比。     

维生素D保护γ射线引起的骨髓基质细胞凋亡

本实验利用骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）克隆形成法、流式细胞仪分析BMSC凋亡、Western—blot分析BMSC内caspase，3蛋白表达研究维生素D对γ射线引起的BMSC损伤的保护作用。小鼠在6Gy的γ射线照射前48h每天皮下注射0．06251ag的1，25二羟基维生素D。结果发现，照射引起小鼠骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU—F）数显著减少。维生素D处理使照射后小鼠的CFU-F与对照组在同一水平。照射使BMSC凋亡率及其caspase-3蛋白的表达显著上升，而维生素D处理可以显著改善这种效果。这些资料说明维生素D具有保护照射引起的BMSC凋亡的作用。     

在DNA损伤修复信号传导通路中ATM介导的BRCA1及RAD51作用机理的研究

为阐明毛细血管扩张性共济失调突变基因（Ataxia telangiectasia mutated，ATM）介导的乳癌基因1（Breast cancer gene 1，Brcal）磷酸化及其下游DNA修复相关蛋白（DNA damage repair protein 51，RAD51）在DNA损伤修复信号传导通路中作用机理，以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞（Originated from human skin fibroblast GM Cell，GM0639）为对照，用免疫共沉淀与Western blot方法，观察^60Coγ射线照射后共济失调症（Ataxia telangiectasia，AT）细胞、ATM转染的AT细胞（ATM^＋ -AT）和GM细胞的BRCA1及RAD51蛋白表达的变化。经0、5、10、20Gy辐照后，AT细胞通过免疫共沉淀及Western Blot法分析其中ATM和BRCA1蛋白以及BRCA1和RAD51蛋白之问的相互作用以及P13K抑制剂对ATM磷酸化其下游基因的影响。0Gy照射ATM^＋ -AT和GM细胞未出现BRCA1表达条带；照射后，GM细胞、ATM细胞BRCA1和RAD51蛋白均有表达，而AT细胞无表达；PI3K抑制剂Wortmannin对经电离辐射照射后的AT、ATM^＋ -AT和GM细胞中BRCA1蛋白表达具有抑制作用；照射后ATM^＋ -AT和GM细胞中BRCA1和RAD51蛋白均有表达。因此，电离辐射照射后，BRCA1由ATM介导磷酸化后可进一步与RAD51相互作用，这是信号通路传导讨程中的一个级联反映．从而修复榻伤的DNA．保持基因组的稳定性。     

抑制HSP90对缺氧肿瘤细胞辐射敏感性的影响

为研究抑制HSP90对缺氧模拟剂(CoCl2)处理的人宫颈癌Hela细胞的辐射敏感性影响,分别用不同浓度的CoCl2处理Hela细胞24 h进行模拟缺氧处理,用不同浓度的HSP90特异性抑制剂17-DMAG预处理细胞16 h,应用γ射线照射细胞,照射剂量分别为2、4、6和8 Gy,采用克隆形成实验观察细胞的存活率,用Western blot实验检测HIF-1α蛋白表达量变化,用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果显示:用CoCl2处理细胞可以诱导HIF-1α蛋白过表达;不同浓度17-DMAG处理组的Hela细胞在不同照射组间的存活率差异具有显著性(p<0.01);17-DMAG预处理缺氧Hela细胞后,HIF-1α蛋白表达随药物浓度增加受到显著抑制,细胞早、晚期凋亡率随药物浓度增加而增加。结果表明:17-DMAG预处理模拟缺氧细胞可增加细胞辐射敏感性并促进细胞凋亡,其机制可能是通过抑制HIF-1α蛋白表达而发挥作用。     

α2M对辐射引起细胞自由基变化的影响

采用６０Ｃｏγ射线照射人皮肤成纤维细胞，并在照射前、后给予不同剂量的甲２巨球蛋白（α２Ｍ），用细胞色素Ｃ法、ＴＢＡ法及邻苯二酚自氧化法分别测定细胞超氧阴离子自由基（Ｏ２）释放、脂质过氧化（ＬＰＯ）水平及超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力。发现细胞受照后Ｏ２释放和ＬＰＯ水平显著增高（ｐ＜０，０１）；Ｏ２释放与照射剂量呈正相关（ｒ＝０．９６６，Ｐ＜０．０１），ＳＯＤ活力显著下降（Ｐ＜０．０１），且与照射剂量呈负相关（γ＝０．９６６，Ｐ＜０．０１）。照射后给予α２Ｍ能显著抑制Ｏ２释放（Ｐ＜０．０１）、降低ＬＰＯ水平。     

姜黄素对辐射诱导的胰腺外分泌细胞损伤的保护作用

将大鼠胰腺外分泌细胞(AR42J)分为实验组与对照组,两组细胞根据姜黄素处理水平又分为A/B/C/D/E 5个姜黄素处理组,分别经0、2、4、8、16 μM姜黄素处理,实验组予以一次性大剂量X射线照射(6 Gy),模拟急性辐射损伤事件。照后收集细胞蛋白行免疫印迹试验(Wensten-blot)检测凋亡相关蛋白PARP、BCL-2,应激及能量代谢相关因子HIF-1ɑ、LDHA、PDH表达情况,MTT法检测细胞增殖活力,荧光酶标仪检测细胞ATP及ROS生成情况。清洁级大鼠24只随机分为对照组、单纯加药组、单纯照射组、照射+加药组,予以12 Gy X射线照射或假照射,射后24小时处死并解剖取出胰腺组织,Wensten-blot检查能量代谢相关蛋白表达情况,以探讨姜黄素在胰腺外分泌细胞辐射损伤中的作用及其机制。结果表明,与对照组相比,单纯照射组细胞在受照24 h后,凋亡蛋白PARP表达升高,BCL-2蛋白下调,线粒体膜电位下降表明线粒体受损。辐照促使缺氧诱导因子HIF-1α表达上调,介导糖酵解的关键因子LDHA表达增强,PDH表达下调。细胞增殖活力下降,ROS生成增多,沉默HIF-1表达在一定程度上抑制了辐照诱导的这种能量代谢转变。经姜黄素预处理,纠正了HIF-1α及LDHA的表达上调,部分恢复PDH表达,有效清除氧自由基,并且对细胞的增殖能力及ATP生成具有正向作用。动物实验显示辐照诱导HIF-1α表达加强,调控能量代谢相关蛋白表达发生改变,LDHA表达增强,PDH表达下调;经姜黄素预处理,纠正了HIF-1α上调所介导的能量代谢相关蛋白的表达变化,趋势与细胞实验相符。以上结果说明,胰腺外分泌细胞在电离辐射损伤下,通过上调HIF-1α表达,促使能量代谢发生转变,糖酵解途径加强,而经线粒体的有氧氧化受到抑制。姜黄素通过下调HIF-1α,纠正了辐射诱导的细胞能量代谢紊乱,并有效清除氧自由基,保护线粒体,从而发挥其对胰腺外分泌细胞的辐射损伤的保护作用。     

X射线全身照射对小鼠胸腺细胞Cyclin B1和p34cdc2蛋白表达的影响

本文采用免疫组织化学法研究了低、高剂量X射线全身照射后不同时间小鼠胸腺细胞CyclinB1和p34^cdc2蛋白表达的变化。结果表明,与假照组相比,75mGy X射线全身照射后8h小鼠胸腺细胞CyclinB1蛋白表达开始升高,12h达高峰,48h恢复至正常水平;而2Gy照射后4h小鼠胸腺细胞CyclinB1蛋白表达开始降低,12h降至最低,24h有回升趋势,48h恢复至假照水平。p34^cdc2蛋白的表达,与假照组相比,75mGy照射后4～48h未见明显变化;而2Gy照射后的时程变化与相同剂量照射后CyclinB1蛋白表达的变化基本一致。提示：低剂量X射线全身照射可诱导小鼠胸腺细胞CyclinB1蛋白表达增强,从而促进细胞周期进程,但对p34^cdc2表达无影响;相反,较高剂量照射导致CyclinB1和p34^cdc2蛋白表达均下降,最终发生G2阻滞。