复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株

以米曲霉M-2为出发菌株,通过紫外线-氯化锂和硫酸二乙脂(DES)复合诱变,筛选酸性蛋白酶高产突变株,并进行固态发酵筛选试验.从大量突变株中进行筛选,获得1株遗传性稳定的酸性蛋白酶高产突变株D-7,其酶活力由出发菌的262.7U/g提高至602.5U/g,提高了129.3%.     

产蛋白酶兼性厌氧菌株的筛选、酶学性质及发酵豆粕应用探究

为筛选得到1 株或几株深层发酵豆粕效果较好的菌株,以透明圈法从自然发酵的豆豉中筛选出4 株兼性厌氧且产蛋白酶菌株,同时发现菌株B-1、B-12在厌氧条件下产蛋白酶能力好于好氧条件,对此现象较明显且平板水解圈直径较大的菌株B-1进行形态学、生理生化和分子生物学实验,鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。进一步对菌株B-1的蛋白酶酶学性质进行研究后发现,酶活力在pH 6.0～9.0的范围内能够维持一个较高的水平,酶反应和酶稳定最适条件为pH 7.0和40 ℃,加入Mn2+对酶反应的促进作用较大。将甲基营养型芽孢杆菌B-1以6%的接种量接种于豆粕固态发酵培养基中堆积（20 cm）发酵,以枯草芽孢杆菌A-12好氧浅层发酵和未发酵豆粕作为对照,发酵结束后测得豆粕中小肽含量和水解度分别高达28.37%和29.55%,比枯草芽孢杆菌固态发酵对照组分别高出了9.04%和16.07%,与未发酵豆粕相比,菌株B-1发酵后豆粕的小肽含量和水解度也分别提高了27.22%和29.13%。     

黑曲霉菌株的诱变筛选及其酸性环境酶活特性研究

用滤纸涂布法从固态发酵的醋醅中分离到1株耐酸黑曲霉菌株。采用常压室温等离子体技术(ARTP)对该菌株进行了诱变,通过专利方法"鉴定霉菌分解淀粉能力的方法"定性筛选出正向突变株,在不同酸度条件下测定了出发菌株和诱变菌株的淀粉酶、蛋白酶活性。测定结果显示,诱变后菌株酸性淀粉酶活和酸性蛋白酶活分别较出发菌株提高53.3%和46.0%,是食醋生产中有潜在应用价值的菌种。     

米曲霉多酶系优良菌株的诱变选育

以米曲霉1-7.3为出发菌株,通过紫外诱变,采用含有不同制霉菌素药物浓度的PDA培养基,初筛得到生长速度快、孢子颜色和菌落形态发生变化的菌株125株.通过制曲复筛进一步得到了一株综合酶系优良的目标菌株80110,该菌株产生的酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活力较之1-7.3分别提高了230.10%和17.50%,糖化酶活力较之传统生产菌株3.042高出15.10%.用80110、1-7.3和3.042三种菌株进行酱油低盐固态发酵比较,80110发酵得到的酱油,总氮含量和氨基态氮含量都明显高于1-7.3和3.042.     

常压室温等离子体诱变技术选育曲霉型豆豉发酵菌种研究

为了提高曲霉型豆豉曲醅中蛋白酶活力,本研究对实验室前期筛选得到的一株蛋白酶活力较高的Aspergillus oryzae NCU-110为原始菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行诱变。结果表明:ARTP处理6min为最佳诱变时间,米曲霉致死率达到91.05%。对诱变处理的菌株进行两轮筛选及遗传稳定性验证实验后发现,突变株A.oryzae NCU-A55显示出高产中性蛋白酶活力和良好的遗传稳定性,酶活力较原始菌株提升了21.0%,达到741.6U/g;蛋白酶系对比实验进一步证实了突变株蛋白酶系以中性酶活力为主的特点,且酶系完整。在制曲60h后中性蛋白酶活力最高,达到958.8U/g,比原始菌株提升了14.7%;形态观察及产孢子能力对比,发现突变株具有菌丝生长速度加快、产孢子能力显著增强的有利表型。这些结果综合表明突变菌株A.oryzaeNCU-A55较高的产中性蛋白酶活性可能与其菌丝体快速生长及产孢子能力增强有关,且比较适合曲霉型豆豉的纯种发酵。     

高产蛋白酶菌株的分离鉴定及诱变

目的:从豆豉中分离出高产蛋白酶的菌株并进行紫外诱变,以提高菌株的产蛋白酶能力.方法:采用酪蛋白平板法,初步筛选出一些产蛋白酶菌株,通过比较发酵后蛋白酶活力,筛选出一株产蛋白酶活力最高的菌株,鉴定其菌种,对该菌株进行紫外诱变,并对诱变后的菌株进行筛选,最后得到一株产蛋白酶活力最高的菌株.结果:分离鉴定后得知菌株B为地衣芽孢杆菌,产蛋白酶活力为2360.80U/mL.最佳诱变时间为120s,菌落致死率为66.68％,得到的高产蛋白酶菌株为B-14,其蛋白酶活力为2922.90U/mL,诱变后菌株产蛋白酶活力提高了23.81％.结论:通过筛选、诱变成功选育出高产蛋白酶的菌株B-14.     

低产蛋白酶A啤酒酵母的诱变选育及在啤酒中试发酵中应用的研究

以啤酒酵母X为出发菌株,用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(亚硝基胍,NTG)和甲基磺酸乙酯(EMS)连续诱变,通过酸变性血红蛋白平板初筛及三角瓶发酵实验复筛,得到一株产蛋白酶A活力低的啤酒酵母突变株GM235.将该菌株进行100L啤酒发酵中试并测定发酵液蛋白酶A活力及各项发酵性能.结果表明:与出发菌株X相比,GM235发酵的啤酒蛋白酶A活力降低了19.83%,降糖能力、双乙酰还原能力略强,正丙醇含量高于出发菌株X,异丁醇、异戊醇、活性戊醇、乙酸乙酯的含量均低于出发菌株X,异戊醇和总高级醇分别降低了5.03%和4.87%;突变株GM235中试生产的啤酒泡沫更为细腻、持久.突变株GM235是一株具有工业应用前景的啤酒酿造酵母.     

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明：该突变株的固态发酵适宜发酵条件为：发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为：酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。     

酱香大曲中产四甲基吡嗪细菌的分离鉴定及其功能性研究

采用稀释平板涂布法从酱香型白酒大曲中分离筛选出细菌菌株19株,模拟酱香型白酒生产发酵工艺,获得2株固态发酵产物具有浓郁酱香气味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。结合菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法,鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。研究发现,菌株FBKL1.0199具有高产蛋白酶的特性,其中性蛋白酶活力达3 925. 80 U/g,酸性蛋白酶活力也相对较高,达139.27 U/g。同时,利用固相微萃取-气质联用技术对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201模拟白酒固态发酵的挥发性香味物质进行分析,发现其中吡嗪类物质相对含量较高,分别为46.01%和48.32%,且均以四甲基吡嗪为主,含量分别为44.11%和47.41%。分离得到的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201可以作为产四甲基吡嗪的功能菌。     

不同菌株固态生料发酵棉籽粕的研究

研究了微生物固态生料发酵对棉籽粕中游离棉酚和蛋白质含量变化的影响。利用12株菌固态生料发酵棉籽粕筛选出高效脱除棉酚菌株和产蛋白酶能力最佳的菌株,在此基础上进行菌株复配发酵棉籽粕。结果表明:单菌棉籽粕固态发酵实验中地衣芽孢杆菌Bl2脱毒效果最佳,脱毒率为42.7%,水溶性蛋白含量8.2%,小肽含量4.19%;产蛋白酶能力较强菌株为Bs1和Bs3,蛋白酶酶活力分别为43.8 U/mL和43.6 U/mL;混菌组合发酵中,从脱毒率和营养价值改善考虑,Bl2+Cu1为最佳组合,其脱毒率为50.03%,水溶性蛋白含量为9.11%,小肽含量为6.98%。混菌发酵效果优于单菌发酵。     

不同菌种制备酱油大曲生产酶系特性及其耐盐性的比较

采用4株米曲霉菌种(j2、y2、x42、x72)与对照米曲霉菌株(沪酿3.042)制备大曲,探究其所产中性蛋白酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶以及糖化酶在盐浓度为0%、5%、10%、15%、20%下酶活力变化。实验结果表明,5株菌株所产酶系中,中性蛋白酶活随盐水浓度的增加显著(P<0.05)下降,酸性蛋白酶和糖化酶在5%盐浓度下活力显著下降(P<0.05),随后酶活力下降速率减慢,α-淀粉酶在5%的盐浓度下无显著下降(P>0.05),随后下降速率加快。此外,相同盐浓度下淀粉酶比蛋白酶更稳定,5株米曲霉菌株的α-淀粉酶和糖化酶在20%的盐浓度下残留率均达到50%。菌株y2、j2所产中性蛋白酶和菌株x72所产酸性蛋白酶的耐盐性优于对照菌株。     

甲基磺酸乙酯(EMS)诱变选育低产蛋白酶A啤酒酵母的研究

采用甲基磺酸乙酯(EMS)对啤酒酵母进行化学诱变,利用酸变性血红蛋白平板筛选得到5株低产蛋白酶A的菌株.通过发酵栓试验,测定发酵综合性能,其中突变株E10在发酵力、双乙酰还原能力和风味物质等综合指标保持了亲株的优良性状,同时蛋白酶A活力显著降低,遗传5代,测其发酵性能,表明遗传性状稳定.     

产纤溶酶菌株根霉12~#的诱变育种及固态发酵培养基的优化

以产纤溶酶的菌株根霉 12 # 为出发菌株 ,对其进行紫外线 氯化锂复合诱变 ,筛选到74株制霉素抗性突变株。所有抗性突变株经进一步固态发酵筛选 ,获得了 4株稳定高产纤溶酶的正突变株 ,其纤溶酶产量分别比出发菌株提高 3 2 9%、2 1 5 %、2 2 3 %和 18 0 %。以其中的 1株为菌种 ,研究了固态发酵产生纤溶酶的培养基组成。采用单因素试验、均匀设计方法对固态发酵培养基的碳源、氮源、碳氮比、初始pH、加水量、无机盐加量进行了优化。结果表明 ,实验范围内根霉 12 # 固态发酵产生纤溶酶的适宜培养基组成为 :m (麸皮 )∶m (豆粕 )=1∶2 ,初始 pH5 0 ,加水量 0 75mL/g物料 ,MnSO4·H2 O和 (NH4) 2 SO4加量分别为 0 2 5 %和1 42 % (对物料 )。优化条件下的固态发酵纤溶酶产量平均达 744 5 7U/g物料。     

海洋低温BS041208菌株选育及发酵培养基的研究(Ⅰ)

以从渤海和黄海分离出的400株在低温条件下生长良好的菌株为出发菌株,利用常规筛选方法筛选出2株低温蛋白酶产生菌(Bacillussubtilis)。经UV、DES、NTG、EMS、LiCl单独及复合诱变,选育出一株(BS041208)蛋白酶高产突变株。通过单因素实验,确定了BS041208菌株蛋白酶发酵培养基为:玉米淀粉糖0.7%,豆饼粉1.6%,K2HPO40.8%,KH2PO40.6%。该突变株低温蛋白酶产量为867.5U/mg。     

He-Ne激光和NTG复合诱变米曲霉提高其蛋白酶和淀粉酶酶活力

以分离自豆酱中的米曲霉(Aspergillus oryzae)HDF-C14为出发菌株,采用He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变的方法获得高产蛋白酶和淀粉酶的突变株HDF-C14-HN5,并将其应用到豆酱发酵中,测定酱曲发酵时蛋白酶和淀粉酶的酶活力。所得成曲中干基蛋白酶酶活力最高可达1572.64U/g,淀粉酶酶活力最高可达2815.23U/g。此生产性发酵实验可以为该菌株投入工业化生产提供技术支撑。     

产蛋白酶耐酸细菌的筛选鉴定及混菌固态发酵豆粕的初步试验

为筛选出与乳酸菌混合发酵豆粕效果较佳的菌株,以透明圈法分别从霉豆腐、发酵豆粕、酱油发酵原液等样品中初筛得到13株产蛋白酶菌株,经过复筛固态发酵豆粕酶活、小肽、水解度的测定和耐酸性实验,最终得到1株耐酸性较好且蛋白酶活力较高菌株A-12,经形态观察、生理生化实验和分子生物学实验,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。利用此菌株与实验室保藏的植物乳杆菌NCU116混合发酵,结果表明,发酵后豆粕中胰蛋白酶抑制因子降解量为98.8%,营养物质如粗蛋白和小肽的含量分别提高了11.04%和13.71%,而且豆粕具有酸香味儿,适口性得到改善;枯草芽孢杆菌A-12可以做为与乳酸菌混和发酵豆粕的1株参考菌株。     

酱香大曲中Geotrichum candidum MTBD菌株筛选及发酵产物研究

对从酱香大曲中分离的白地霉菌株Geotrichum candidum MTBD进行了鉴定,并对该菌株的固态发酵和液态条件下产蛋白酶及其产酶条件进行了研究,以及该菌株利用酿酒原料的固态和液态发酵产物分析。结果表明,该菌株能产较高活力的蛋白酶,发酵代谢产物包括酸类、酯类、芳香族化合物、醛酮类、含氮化合物等多种成分,与茅台地区酱香型白酒的风味成分分析结果进行比较分析,结果表明,该菌株也是酱香型白酒生产的主要功能菌株,对提供发酵动力和风味形成具有重要的贡献。     

基于物理诱变的米曲霉高产菌株的选育及应用

以实验室筛选的1株米曲霉为出发菌进行紫外诱变,经过多次筛选后得到1株中性蛋白酶活力显著提高且遗传性较稳定的突变株22#。用该菌株与另外2种市售菌种进行酱油低盐固态发酵,结果表明:经诱变得到的22#米曲霉菌株的成曲酶活力及全氮利用率都相对较高,分别达到1549.15U/g和65.48%,虽氨基态氮含量相对略低于"迪发"牌米曲霉,但仍具有一定潜在的生产应用价值。     

红曲菌mrfA缺失突变株发酵过程中的生理生化特征

为了解红曲菌G蛋白信号调节子mrfA缺失突变株发酵过程中的生理生化特征,测定了该突变菌株在液态发酵过程中的生物量、葡萄糖利用率、pH值、蛋白酶、几丁质酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性。与原始菌株红色红曲菌M7相比较,mrfA缺失突变株在生长后期生物量会明显减少,在发酵过程中葡萄糖消耗率、蛋白酶和几丁质酶均高于出发菌株,其中蛋白酶活力在第6天达到最高。与此同时,mrfA缺失突变株的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶酶活也均高于出发菌株M7。这些结果初步表明mrfA缺失突变株与原始菌株相比自溶特征更加明显,推测蛋白酶是诱发菌体自溶的主要水解酶,超氧化物歧化酶是其防御氧化应激的主要酶。研究结果为进一步理解mrfA介导的红曲菌自溶机理奠定了基础。     

洋河大曲中糖化酶高产霉菌的筛选鉴定及固态发酵条件优化

从洋河酒厂中高温大曲中利用透明圈初筛得到5株霉菌,通过固态发酵测定酶活复筛的方法分离出1株产糖化酶且酶活性较高的霉菌菌株(编号YH-01),根据其形态特征和ITS序列分析,该菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)。以该菌株为出发菌株,通过单因素试验和正交试验,优化固态发酵条件,测得糖化酶在料水比5∶3、装料量40 g/500 m L、发酵时间6 d时活力最高。