GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步。条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异。通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础。     

植物乳杆菌的比较基因组学研究

植物乳杆菌是一类与人类的生活关系密切,具有多种益生功能的乳酸菌。随着高通量测序技术的广泛应用,越来越多的植物乳杆菌基因组全序列测定得以实现。以植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组为主要研究对象,采用比较基因组学分析和比较了几株测序的植物乳杆菌的基因组特点,重点分析了与植物乳杆菌素、蛋白水解系统,糖代谢和胞外多糖合成相关基因,为植物乳杆菌研究和应用提供参考。     

植物乳杆菌在肉鸡生长中的应用研究进展

植物乳杆菌作为一种活的微生态制剂,其具有无残留、无抗药性的特性,成为目前流行的一种饲料添加剂。文章主要对植物乳杆菌的生理学特性以及其对肉鸡生长性能、免疫、抗氧化和肠道健康的影响进行论述。     

一种基于单交换原理的地衣芽孢杆菌基因敲除方法及应用

目的:基于同源单交换原理构建地衣芽孢杆菌基因快速敲除方法,提高基因敲除效率。方法:以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)20085内切纤维素酶基因celb为拟敲除对象,利用重叠PCR技术将celb基因内约500bp片段与氯霉素抗性基因(Cmr)相连接,经末端单酶切后电转化至B.licheniformis 20085感受态细胞中,仅通过一次同源单交换,将抗性基因Cmr插入至celb基因内部,实现目的基因的敲除。结果:经过氯霉素抗性筛选和基因组PCR鉴定,成功获得celb基因缺失菌株B.licheniformis 20085Δcelb;发酵验证结果显示,B.licheniformis 20085Δcelb较原始菌株滤纸崩解能力显著降低,其中发酵60h后内切纤维素酶(CMC酶)活力由1.86U/ml降低至0.50U/ml,表明celb基因在地衣芽孢杆菌降解纤维素的过程中起着重要作用。结论:通过重叠PCR技术结合同源单交换原理能够实现地衣芽孢杆菌目的基因的快速敲除,为该菌株甚至其它微生物提供了一种基因功能快速鉴定的手段。     

基于IRES序列的多基因共表达载体构建

目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和HeLa两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白质免疫印迹实验表明,DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组,并且两种蛋白质表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。     

含HSV-TK基因及IL-18基因复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:分别构建含TK及IL-18基因的重组腺病毒载体,并进行鉴定。方法:通过DNA重组技术,构建含有目的基因的复制缺陷型腺病毒Ad CMV-TK及Ad CMV-IL-18;将上述重组腺病毒液感染293细胞,提取DNA,进行PCR鉴定;将病毒液感染293细胞,扩增病毒,用OD260法测定病毒滴度。结果:经PCR鉴定,鉴定正确的腺病毒命名为Ad CMV-TK及Ad CMV-IL-18,测定病毒滴度Ad CMV-TK=1.28×109 PFU/m L;Ad CMV-IL-18=1.28×109 PFU/m L。结论:成功构建了含HSV-TK基因及IL-18基因重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了理论依据及实验数据。     

鲍曼不动杆菌RND外排泵基因对耐药性的影响

目的 探讨敲除鲍曼不动杆菌耐药结节化细胞分化家族(resistance-nodulation-cell-division family,RND)外排泵基因adeB、adeB-like、adeFGH、adeIJK对耐药性的影响。方法 采用自杀性载体pMo130-Telr同源重组法敲除鲍曼不动杆菌AYE的RND外排泵相关基因。琼脂二倍稀释法或微量肉汤稀释法对敲除前后菌株进行17种抗菌药物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)检测。结果 成功获得AYE△adeB、AYE△adeB-like、AYE△adeFGH、AYE△adeIJK菌株。1)AYE△adeB菌株MIC值降低到原MIC的1/4或更低的抗菌药物有:亚胺培南、舒巴坦、氨苄西林舒巴坦、头孢西丁、阿米卡星、卡那霉素、环丙沙星、米诺环素、替加环素,MIC值降低到原MIC的1/2的抗菌药物有:美罗培南、氨苄西林、头孢哌酮、头孢哌酮舒巴坦、头孢他啶、左氧氟沙星、多粘菌素E。2)AYE△adeB-like菌株MIC值降低到原MIC值1/2的抗菌药物有:美罗培南、氨苄西林、头孢西丁、环丙沙星、左氧氟沙星、米诺环素、替加环素、多粘菌素E。3)AYE△adeIJK菌株MIC值降低到原MIC值1/2的抗菌药物有:美罗培南、氨苄西林、左氧氟沙星。4)AYE△adeFGH菌株MIC值降低到原MIC值1/2的抗菌药物只有多粘菌素E。结论RND外排泵基因对鲍曼不动杆菌耐药性具有不同程度的影响,其中adeB对鲍曼不动杆菌AYE的耐药性影响最明显。     

乳果糖和乳杆菌的复合物对猪肠道环境和性能的影响

为测定乳果糖益生元、乳杆菌益生元(植物乳杆菌)和两种的组合作为29³9日龄断奶仔猪生长促进剂的作用效果。将96头仔猪按初始体重分到32个圈舍中,并将其分为4组,包括对照组(CTR)、在基础饲粮中添加植物乳杆菌(109cfu·mL-1乳杆菌喷到基础饲粮上,每头猪20 mL,LPN)、乳果糖(LAC)10 g·kg-1、两种处理的混合(SYN)。在近端结肠食糜中采样,测定肠腔内pH、短链脂肪酸(SCFA)和乳酸的浓度。通过末端限制性酶切片段长度多态性分析(T-RFLP)和qPCR对结肠食糜中提取脱氧核糖核酸和微生物菌落进行评价。对尿素氮(BUN)和急性时相蛋白(Pig-MAP)进行测定,LAC组采食量(P<0.05)、平均日增重(P<0.01)、料重比(P<0.05)提高,并极显著的降低了BUN(P<0.01)。LAC和LPN组肠道乳酸杆菌的数量减少,结肠内容物的比率(P<0.05)。此外,LPN组的支链脂肪酸百分含量降低(P<0.01),这说明蛋白水解微生物的活性降低了。通过T-RELP对肠道内容物中微生物的分析发现,肠道内微生物的种类发生变化。与对照组相比,试验组的嗜热酸双歧杆菌与末端限制性酶切片段(TRFs)的相似性较高(P<0.05)。研究结果表明,乳果糖和植物乳杆菌的组合可以作为一种互补的合生素使,但不具备协同作用。     

proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了pro C和put P敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,pro C敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。put P敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,put P的敲除比pro C的敲除更有利于精氨酸的合成,put P的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。     

新型肠毒素蛋白SElK编码基因的克隆测序、生物信息学分析和表达载体构建

采用微波加热法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,根据NCBI上登录的肠毒素基因sek设计引物,PCR克隆selk基因,对selk基因测序并进行生物信息学分析,在此基础上构建重组表达质粒p ET-32a(+)-selk.测序结果表明本研究克隆得到具有正确编码序列的新型肠毒素selk基因;Protparam分析表明在一级结构水平上该蛋白具有较高的热稳定性;亲疏水性分析表明SEl K蛋白是一个亲水性较高的蛋白质;同源建模表明SEl K蛋白的domain B结构域缺乏传统肠毒素所具有的胱氨酸环,但SEl K蛋白domain B中β-折叠片数量比传统肠毒素更高.这些结果为进一步研究SEl K蛋白的结构与功能奠定基础.     

SCN3A基因突变型表达载体的构建及在HEK 293细胞中的表达

目的体外构建含有SCN3A基因mRNA片段的质粒pCMV_6-XL_4-SCN3A的突变体N302S(c.905A>G),为进一步的功能研究奠定实验基础。方法设计带突变位点的引物,以野生型质粒为模板进行定点诱变,构建突变质粒。质粒经扩增纯化后瞬时转染到HEK293细胞中,24 h后用RT-PCR方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定及测序证实突变成功。突变质粒转入HEK293细胞系24 h后,RT-PCR可以检测到目的基因的表达。结论本实验成功地构建了SCN3A基因突变型真核表达载体pCMV_6-XL_4-SCN3A-N302S,并在基因水平上验证了能在HEK293细胞中表达。     

玻璃墙构造设计及应用

玻璃墙是一种结构特殊、特点鲜明的幕墙,本文着重阐述了玻璃墙的组成、分类、构造特点、设计难点及适用范围。     

浅谈重混凝土施工技术与应用

为了对电离辐射进行生物防护,海南昌江核电站核辅助厂房部分装载放射性工艺设备房间的墙板采用了有防辐射作用的赤铁矿重混凝土,以防止核电站运行时产生的放射线泄漏至房间外。本文以该墙板施工为背景,介绍了重混凝土的性能指标、配合比设计及施工技术。     

浅谈搅拌桩施工技术及应用

介绍了垂直搅拌桩、水平搅拌桩和插筋搅拌桩的成桩机理、施工技术及其应用范围，为软弱地质条件下的施工提供了一种有效的方法，并使搅拌桩的应用得到了拓展。     

支持向量机在隧洞超挖预测中的应用

介绍了支持向量机算法及围岩破坏模式识别的支持向量机算法,利用支持向量法分类算法对隧道围岩超挖块体的大小进行了分类,并建立了预测模型,计算结果表明用支持向量机能较好地预测超挖块体的大小。     

位移矢量角在堆积层滑坡预测预报中的应用研究

引入能反映滑坡坡体受力方向变化规律的特征参数——位移矢量角,运用有限元程序ANSYS进行数值模拟,研究堆积层滑坡在不同部位的位移矢量角变化趋势,为滑坡预测预报提供参考依据。     

非线性位移时间序列预测的进化-支持向量机方法及应用

提出了一种新的岩土结构位移预测的进化支持向量机方法,用遗传算法来搜索支持向量机的参数和核函数,避免了人为选择参数的盲目性,同时提高了支持向量机的推广预测能力;利用这种非线性智能预测方法,滚动预测施工位移变形量,以便及时调整和优化施工步序,维护岩土结构的稳定性。将该方法用于卧龙寺边坡变形、三峡永船闸边坡变形预测,结果表明,该方法具有科学可靠、实时性的优点,具有广泛的应用前景。     

边坡可靠性评价的向量投影响应面研究及应用

岩土体的力学参数存在一定的随机性,当进行边坡稳定可靠性评价时,当功能函数不能用显式表达时,响应面法成为计算可靠度指标的重要方法。将向量投影响应面法与有限元强度折减法相结合,研究隐式功能函数边坡工程稳定可靠度计算方法。首先利用强度折减法结果拟合稳定系数计算方程从而代替隐式方程,并建立极限状态方程,然后进行向量投影以确定展开点和抽样点,进行近似方程的拟合、验算点和可靠度指标的计算,直到计算达到收敛。通过与不同计算方法进行对比,表明区别于通常以插值点为中心展开生成样本点的向量投影取样法的准确性和合理性,该方法可使可靠性分析次数显著减少,改善了对非线性程度较高的极限功能函数求解可靠指标的收敛性。同时,将该方法应用于杭兰高速公路大水田边坡的稳定可靠性分析当中。