基因工程方法抗甜菜丛根病病毒育种的研究：（Ⅰ）甜菜坏死黄脉病毒外 …

采用含有甜菜坏互黄脉病毒外壳蛋白（ＢＮＹＶＶ ＣＰ）基因的农杆菌，分别以不同甜菜品系的叶柄、下胚轴及子叶为外植体材料进行基因转化研究。含有ＢＮＹＶＶ ＣＰ基因和卡那抗性筛选基因的农杆菌与甜菜组织不同外植体共培养后，经过诱导分化培养，在含有卡那霉素的培养基上，从叶柄及下胚轴分别直接诱导出抗卡那霉素再生芽，而从子叶上只诱导出紧密型绿色愈伤组织，未分化出不定芽。从叶柄及下胚轴诱导两生芽的诱导培养基分别为     

甜菜遗传转化及PCR检测

用农杆菌介导方法,将甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白（BNYVV CP）基因和丛根病外壳蛋白（BBSV CP）基因转化甜菜不同品系茎节外植体。以卡那霉素作为筛选标记基因,获得抗卡那霉素再生植株。再生植株经PCR扩增,获得目的基因大小的DNA片段,初步证明为转基因植株。     

甜菜转基因植株抗性表现及种子获得

用农杆菌介导方法，将甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白（BNYVV CP）基因转化甜菜不同品系叶柄外植体。以卡那霉素作为筛选标记基因，获得抗卡那霉素再生植株。再生植株经PCR扩增，获得目的基因大小的DNA片段，初步证明为转基因植株。部分转基因TO代植株在病土中实验表明，其抗病性明显高于对照。将移栽田间所获得的转基因甜菜母根进行单株套罩采种，获得不同品系单株自交种。     

二步培养和AgNO3对甘蓝型油菜子叶和下胚轴芽再生的影响

以甘蓝型油菜（Brassica napus L．）品种浙双758为材料,研究二步培养及添加AgNO3对甘蓝型油菜子叶和下胚轴外植体离体再生的影响。外植体先在含0．5—1．5mg／L2,4-D的MS培养基上预培养3d或7d诱导愈伤组织的产生,再转到含有3mg／LBA和0．15mg／LNAA及添加或不添加2．5mg／LAgNO3的分化培养基上诱导芽的分化。结果表明,外植体愈伤组织诱导率和芽再生率与2,4-D浓度、预培养时间和AgNO3密切相关;分化培养基中添加银离子可显著增加不定芽的再生频率;二步培养及添加AgNO3可使半子叶、完整子叶和下胚轴外植体芽再生频率分别达到了96．1％,96．7％和96．7％。     

花生组织培养及高频率植株再生

以14个花生品种为材料,对花生组织培养及植株再生进行了研究。将花生成熟胚幼叶、子叶和下胚轴外植体接种到添加0—2mg／LNAA和0～10mg／LBAP的MSB,（MS无机盐＋B5有机）培养基上诱导愈伤,再转到添加0～10mg／LBAP的分化培养基上诱导不定芽。结果表明,诱导培养基中添加的激素及其浓度对以后在分化培养基上不定芽分化有重要作用,以添加1mg／LNAA和6mg／LBAP最利于不定芽分化;分化培养基中添加4mg／LBAP利于不定芽伸长及植株再生;幼叶外植体分化不定芽频率明显高于子叶和下胚轴;不同基因型不定芽分化率存在明显差异,白沙1016和花育23幼叶外植体获得了较高的不定芽分化率,分别达到91．8％和88．5％。再生苗经生根培养和驯化后,移栽花盆可正常开花结果。     

甜菜组织培养直接器官发生和植株再生

根据甜菜营养生长的特点，通过在MS培养基中添加植物激素BA和NAA或IBA，建立了由茎节和叶子两种外植体的直接器官发生再生植株的技术。     

培养条件对紫苏下胚轴外植体再生的影响

以紫苏下胚轴为材料,研究紫苏外植体芽再生的影响因素。结果表明：苗龄、黑暗时间、激素浓度及配比对紫苏芽再生均有较大影响。取13d苗龄的下胚轴先在分化培养基（MS＋3.0mg/L BA＋0.3mg/L NAA）黑暗预培养8d后转为14h/d光照条件培养可获得较高的再生频率。诱导芽苗生根最佳培养基为1/2MS＋1.0mg/L BA＋0.3mg/L IAA。     

甜菜组织培养中外植体褐变影响因素的研究

通过对组织培养中甜菜品系的染色体倍数性、无茵苗的苗龄、外植体部位及生理状态、培养基成分、光照条件的实验发现，这些因素均对甜菜组织培养过程中外植体褐变有影响。实验结果表明：二倍体品系制成的外值体在相同条件下要比四倍体品系的外植体发生褐变的时间延长，而且二倍体褐变的频率也低于四倍体：超过6周的无菌苗的外植体极易褐变；下胚轴、胚轴、叶柄出现褐变的时间早于叶片；NAA浓度超过O．2mg/L褐变率明显增高；光照时间超过16h的外植体很快褐变，光照强度在3000-4000k时，外植体虽然有不同程度的褐变．但再生率较好。     

蓖麻组织培养和植株再生的研究

建立了一种有效的蓖麻植株再生体系。以蓖麻成熟种子胚轴为外植体,在含6-BA（0．5mg／L）的MS培养基上每个外植体均能诱导出由若干不定芽组成的丛生芽,平均每个外植体可产生6．3个不定芽,健壮的不定芽经伸长、生根而发育成完整的再生植株并能全部移栽成活。本实验所用的3个蓖麻品种在产生不定芽的能力和数量上没有明显差异。利用该体系所诱导的不定芽具有生长健壮和易于生长发育等特点。该再生体系的建立为蓖麻遗传转化研究奠定了基础。     

檀香体细胞胚胎的发生及植株再生的研究

目的 通过诱导檀香体细胞胚胎(体胚)发生获得再生植株,为檀香的基因工程提供受体系统.方法 分别以檀香幼嫩叶片、茎尖和近成熟胚为外植体,在添加TDZ和其它植物生长调节剂的MS培养基上诱导体胚的发生,再将发育成子叶型的体胚转移到含赤霉素(GA3)的培养基上萌发成完整植株.结果 叶片外植体在附加1.1μmol/L TDZ的MS培养基最适于体胚的发生,体胚发生率为91.2%;体胚在附加1.4 μmol/L GA3,蔗糖含量为4%的MS培养基上的萌发率达100%,但形成的檀香幼苗未见根生长.结论 1.1μmmol/L的TDZ能诱导檀香叶片和近成熟的种子胚外植体形成体胚,体胚在附加1.4 μmol/L GA3的MS培养基上能萌发,但萌发的幼苗没有生长出正常的根.     

亚麻高效再生体系的优化研究

为了优化亚麻再生体系,对基因型、外植体的选择部位、基本培养基、植物生长调节剂等影响亚麻植株再生的因素进行了优化,建立了亚麻下胚轴高效组织培养再生体系.结果表明,亚麻种子消毒采用75%乙醇处理3min,再用0.1%升汞灭菌3min效果最好;亚麻下胚轴的下部是最佳外植体;在Y4培养基下（MS1＋NAA0.02mg/L＋6-BA1mg/L）,亚麻愈伤组织的诱导率和分化率最高,分别达到98.89%和95.56%;最佳生根培养基是1/2MS＋NAA0.001mg/L,生根率达90%;同时可以看出,不同基因型再生能力不同.与派克斯和华星009相比,再生能力最强的品种是中亚2号.通过再生体系优化使亚麻愈伤组织的诱导率和分化率以及再生植株的生根率都有所提高.     

转RIPs基因甜菜的分子检测和抗病性鉴定

对利用农杆茵介导法转化的经卡那霉素筛选的转核糖体失活蛋白(RIPs)基因甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测,并对分子检测呈阳性的转基因甜菜植株接种甜菜褐斑病菌,接种20d后,发现75%植株具有抗病性.     

沿海甜菜(Beta maritima L.)的组织培养及植株的再生

本文研究了属于普通甜菜群的一个野生种——沿海甜菜(Btea maritimaL.)的组织离体培养。用叶片、腋芽、花序为外植体进行培养,获得了再生植株。采用MSB为培养基,单独附加6—苄氯基嘌呤(6—B A)或以6—苄氨基嘌呤加萘乙酸(NAA)的组合,对叶、花序及腋茅诱导不定茅的发生取得了较好的效果。采用MS或MSB大量元素减半,附加一定量的萘乙酸可诱导生根,移栽成活率高。     

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

甜菜畸胎瘤的重复诱导及其形态观察

1983年采用致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefacies)的C58、T37、B3/73三个菌种,感染Beta Vulgaris和B.maritima二个种的106个品种和品系。在102个品种上诱导出冠瘿瘤。其中,B.Vulgaris品种和一个野生杂种诱导出畸胎瘤。为进一步验证诱导畸胎瘤的重演性及形成条件,今年又设置了重复试验,实验结果,再一次形成了畸胎瘤(图1—2)。经过对畸胎瘤幼苗叶片生化检测,叶片中含有胭脂碱(图3)。证明胭碱合成酶基因,在细胞再生过程中仍然保存在再生植株中。畸胎瘤的重复出现,为解决含T—DNA细胞系的再生,开展甜菜基因工程的研究,奠定了良好的基础。     

草珊瑚的组织培养及植株再生研究

目的 草珊瑚茎段离体培养研究,解决草珊瑚人工栽培中种苗短缺问题.方法 用茎段作外植体,以MS,White,N6和B5为基本培养基,附加不同浓度的激素进行培养.结果 MS基本培养基较佳;芽的初代诱导用MS BA 1.0 mg/L,诱导率80%;增殖继代用MS BA 2.0 mg/L NAA0.3 mg/L培养基,增殖系数达6.2;根的诱导用1/2MS IBA1.0 mg/L培养基,生根率100%.结论 本研究得出的方法可为栽培草珊瑚提供大量种苗.     

尾穗苋种子萌发及愈伤组织的诱导研究

以尾穗苋为实验材料,对种子萌发形成无菌苗的影响因素进行了优化,并探讨了不同激素配比对尾穗苋无菌苗下胚轴和子叶愈伤组织诱导的影响.结果表明,采用0.01%升汞消毒l min,l/2MS(所有元素均减半)培养基及暗培养1 d,第7 d的种子萌发率高达82.7%;以MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L的培养基诱导尾穗苋子叶和下胚轴形成愈伤组织效果较好,均达到100%.     

花生胚小叶的离体再生及筛选压力选择

以花生胚小叶为外植体优化离体再生条件,通过对再生苗进行筛选,为外源基因的遗传转化提供实验依据。研究表明,不同基因型胚小叶的再生能力差异显著,在供试基因型中以中花8号不定芽诱导率和成苗率最高,且外植体状态最好。中花8号胚小叶再生的最佳诱导培养基为MSB（MS无机盐＋B5有机成分）＋6-BA（4.5mg/L）＋NAA（1mg/L）＋AgNO3（2mg/L）,最佳诱导培养时间为21d。对中花8号再生苗进行筛选浓度实验,草丁膦（PPT）为20mg/L时,可筛选出抗性苗;300mg/L的卡那霉素（Km）可用于较小幼苗筛选,而对较大幼苗则需将Km的浓度提高至400mg/L以上。     

杜仲疏松愈伤组织诱导条件的优化筛选

杜仲愈伤组织生长过于致密从而导致难以实现悬浮培养,因此获得疏松、生长快速愈伤组织是实现杜仲细胞悬浮培养的前提.本文研究了不同外植体、激素和培养基对杜仲愈伤组织诱导率、疏松程度以及褐化率的影响,结果表明：上胚轴和子叶更容易被诱导为疏松愈伤组织,MS培养基是最适诱导培养基;适当增加6-BA浓度有助于褐化的减轻且提高愈伤组织疏松程度,杜仲疏松愈伤组织诱导最适激素配比为1.0mg/L 2,4-D＋1.0mg/L NAA＋1.0mg/L 6-BA.     

细菌几丁质酶基因转化烟草的研究

为了提高烤烟品种K 32 6对真菌病害的抗性 ,以烟草再生植株的叶片为受体 ,采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因导入烟草 ,获得了抗卡那霉素的转化植株 ,经PCR检测 ,初步证明了细菌几丁质酶基因已整合到烟草的基因组中 ;同时研究了再生烟草叶片的耐卡那霉素水平、受体预培养对转化的影响以及促进转化植株的生根等。结果表明 :培养基中卡那霉素浓度为 5 0mg/L时 ,能完全抑制烟草叶片的再生 ;烟草叶片预培养 2d的转化率提高 ;添加 0 .2mg/LIAA(吲哚乙酸 )能显著地提高转化植株芽梢的生根率。