基于芯片数据的烟草qRT-PCR内参基因鉴定与验证

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果的准确性关键在于选择合适的稳定内参基因,而常用持家基因的表达不是恒定不变的,无法满足qRT-PCR准确定量的要求。为发掘烟草中优于传统持家基因的新内参基因,分析了烟草100张基因芯片数据,鉴定了稳定表达的候选内参基因,并利用烟草各个发育时期的RNA样品,通过qRT-PCR实验比较并验证了其表达的稳定性。结果显示,新鉴定的烟草内参基因HSC70-1表达稳定性优于所有的常用持家基因,HSC70-1,L25,EF-1α和HIST2H3A为烟草qRT-PCR实验中的最优内参基因组合,同时使用4个基因进行校正和标准化获得了可靠的定量结果。     

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。     

烟草GA代谢相关基因ga1和ga2的克隆和表达分析

为了解赤霉素（gibberellic acids, GA）在烟草生长发育中的作用,本研究利用同源克隆和RACE技术分离了3个烟草种GA代谢相关基因ga1和ga2的6条序列,对其进行了序列比对和进化分析;并利用荧光定量表达分析研究了其在林烟草和普通烟草中的表达谱。结果表明,相关基因在烟草属和茄科作物中保守性很高;普通烟草中克隆的ga1和ga2可能起源于绒毛状烟草。表达分析表明,ga1和ga2在林烟草生长发育早期和茎伸长期分别在叶和茎中的表达量显著高于其他组织。     

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

  背景和目的  近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。  方法  采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。  结果  三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。  结论  我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。      

油菜种子含油量相关的脂肪酶基因BnSDP1克隆与表达分析

通过电子延伸和RACE（cDNA末端快速扩增）克隆得到一个与油菜种子含油量相关的脂肪酶基因,命名为BnSDP1,其开放阅读框为2 472bp,编码分子量为92kD的蛋白,预测等电点为6.75,具有保守的patatin结构域,跨膜域位于N端和中间,序列分析显示BnSDP1拥有GXSXG脂肪酶的基本特征序列GSSVG。利用RT-PCR技术分析发现,在种子发育的成熟期（即脱水期）,BnSDP1在低油品系种子中的转录水平高于高油品系,在根、茎、叶、花中均有表达,但在根和叶片中表达量高,在根中尤其显著,且受蔗糖诱导上调表达。     

特异性siRNA质粒的构建及其抑制癌细胞中mcl-1表达的研究

本文构建了靶向mcl-l基因构建的特异性siRNA重组质粒,在细胞水平检测的其抑制效果,并筛选出能高效抑制mcl-l基因表达的siRNA重组质粒,针对mcl-1的特异性siRNA重组质粒,将其转染到人肝癌细胞HepG2,用Rt-PCR(实时荧光定量PCR)方法和WesternBlot方法分别检测转染前后mcl-1mRNA水平和Mcl-1蛋白表达水平,比较对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1的抑制效果。结果表明,Rt-PCR结果显示对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1均可降低mcl-1mRNA水平,最大抑制效率达70.0%,远高于作为对照非相关组;Western-Blot结果显示转染特异性siRNA重组质粒后Mcl-1蛋白表达受到抑制,最大抑制率为44.2%。合理设计的特异性siRNA重组质粒可大幅度下调mcl-1mRNA水平,能有效抑制Mcl-1蛋白表达。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

烟草DGAT3基因响应冷胁迫应答的功能研究

二脂酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）是催化三脂酰甘油（TAG）合成途径的关键酶,在植物生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的作用。本研究从普通烟草品种K326中克隆得到NtDGAT3基因,利用荧光定量PCR技术分析不同组织中和低温胁迫下NtDGAT3的表达规律。同时,利用CRISPR/Cas9技术制作NtDGAT3敲除植株,对其耐冷性进行了分析。结果表明,NtDGAT3在烟草根、茎、叶中均有表达,且叶部表达量最高;NtDGAT3受冷胁迫强烈诱导,说明该基因可能对冷胁迫有响应。低温处理试验结果表明,敲除突变体ntdgat3对冷敏感,突变体叶片离子渗漏率及丙二醛含量的变化幅度显著高于野生型烟草;在ntdgat3中,膜脂代谢关键基因PLDα1的表达水平显著高于野生型烟草,而PLDδ的表达水平显著低于野生型烟草。以上结果表明,NtDGAT3基因通过PLDα1和PLDδ的表达参与调节植物低温响应。     

四川和河南烤烟叶片番茄红素β环化酶基因的表达分析

为了探明四川和河南烤烟烟叶类胡萝卜素差异的分子机理,揭示同一品种烤烟在四川和河南产生不同香气风格的机理,采用半定量RT-PCR和Northern杂交方法检测了四川和河南烤烟现蕾期叶片中类胡萝卜素合成关键基因番茄红素β环化酶基因(Lyc-β)的表达水平,并用高效液相色谱法测定了同期烟叶中类胡萝卜素的含量。结果显示,四川烤烟现蕾期叶片中Lyc-β基因的表达水平显著高于河南的;四川烟叶的叶黄素和β胡萝卜素含量显著高于河南的。     

烟草组织蛋白酶B基因的结构特征分析及mRNA表达

为了明确烟草中组织蛋白酶B基因的功能,对烟草组织蛋白酶B基因(NbCathB)进行了序列分析.该基因ORF长951bp,编码316个氨基酸.该基因蛋白质的预测分子量为35.2 kD,等电点为6.14.对NbCathB的基因结构分析显示,该基因具有8个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则.比较NbCathB和AtCathB基因,显示两者编码氨基酸序列一致性为61％.通过SMART软件分析,NbCathB和AtCathB基因的结构域很相似.在上清液、菌体、菌液以及水4种处理烟叶中的表达谱鉴定显示,在喷施MP制剂(巨大芽孢杆菌)菌体和菌液的烟叶中NbCathB的表达量明显高于在喷施MP制剂上清液的烟叶中的表达量,而在喷施水的烟叶中的表达量最低.说明NbCathB很可能发挥了AtCathB相同的作用.     

印度梨形孢诱导烟草的抗病性分析

内生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)能够增强植物体抗生物和非生物胁迫能力.为了明确印度梨形孢对诱导烟草抗病性的作用,分别进行了接种病原菌长柄链格孢、胶孢炭疽菌、终极腐霉和茄丝核菌后印度梨形孢定殖的烟草对赤星病、炭疽病、猝倒病和立枯病害的抗性试验,同时分析了接种长柄链格孢后烟叶中丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量、抗氧化酶活性以及病程相关蛋白基因表达水平.结果表明:印度梨形孢定殖的烟草,接种长柄链格孢后,烟叶病斑显著减小,烟叶中MDA含量显著降低,Pro含量显著升高,病程相关蛋白基因PR-1a,PR2,PR3和PR5的表达量明显提高;接种胶孢炭疽菌后,烟叶病斑减小;终极腐霉和茄丝核菌对烟草的危害症状显著减轻.印度梨形孢能诱导烟草产生抗病性,是通过维持生物膜系统的完整性、稳定细胞内渗透压以及膜脂过氧化在较低水平、并调控病程相关蛋白基因的表达来实现的.     

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。     

钾对烤烟叶片解剖结构的效应及其品种差异

本研究通过对不施钾（N：P2O5:K2O=1:2:0),标准施钾（N：P2O5：K2O＝1：2：3）和高施钾（N：P2O5：K2O＝1：2：5）3个施钾水平对4个烤烟品种（NC27NF,G－28,净叶黄和TI112）的烟叶组织结构的影响进行研究。结果表明,随着施钾量的增加,4个品种烟叶含钾量也增加的同时,其中的厚度,海绵组织厚度和栅栏组织的胞间隙均呈减小趋势,它们与施钾量构成显著的负线性关系。而组织比和栅栏组织厚度则呈现逐渐增加的趋势,构成显著的正线性关系。钾元素能显著地改善烟叶的解剖结构,提高其内在品质。施钾后烟叶海绵组织的变化明显大于其它组织部分。研究还表明,钾对不同品种的叶片内部的不同部位组织的影响强度表现出明显的不一致性。     

烟草橙蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了获得烟草OR(NtOR)基因的全长序列和进一步揭示其在特色烟叶形成中的作用,采用同源克隆法从烟草品种K326中克隆了NtOR的全长cDNA和基因组DNA序列,GenBank登录号为JN379458和JN375578.生物信息学分析表明,NtOR基因组DNA全长5027bp,cDNA为1188 bp,编码317个氨基酸残基.NtOR蛋白具有2个跨膜域、1个信号肽剪切位点、5个糖基化位点和11个磷酸激酶修饰位点,二级结构包含12个α-螺旋和20个β-折叠,亚细胞定位于质膜上.系统进化与BLAST分析表明,NtOR是SlOR和ViOR的垂直同源基因.GENEVESTIGATOR数据库的芯片结果显示,NtOR基因在子叶中的表达量最高,其次是成熟叶片、幼茎和花,其他组织器官的表达相对较弱.     

低氮胁迫诱导烟草亲环素基因表达的研究

为研究低氮营养对烟草生长的主要影响,分别在移栽后50d到70d期间测量了低氮胁迫和正常营养条件下烟株中部叶片的叶宽、叶长和50d与60d时的株高,同时应用实时荧光定量PCR方法分析了移栽后50d到70d期间烟草叶片中胁迫响应基因亲环素mRNA的表达量.结果发现低氮营养下叶长、叶宽和株高都小于正常营养条件下的叶片,但是叶长、叶宽平均生长增幅显著大于正常营养下的叶片,而株高的增长幅度则没有明显差异.低氮胁迫下叶片亲环素基因mRNA表达量与正常条件下的基因转录表达量相比有显著增加,最高为正常条件下的6.9倍,并且在移栽后50d到70d期间相对转录水平呈递增趋势.水培实验也证明低氮胁迫可显著诱导叶片亲环索基因的转录表达,诱导表达量达2.0倍之多.结果表明低氮营养胁迫对烟草叶片的生长影响较为显著,且低氮营养可以诱导烟草叶片亲环素基因mRNA表达大量增加,推测低氮营养胁迫下亲环索基因的大量诱导表达可能参与了对烟草叶片生长的调节过程.     

烟草类胡萝卜素双加氧裂解酶基因的克隆与序列分析

为揭示类胡萝卜素双加氧裂解酶基因(CCDs)在烟草生长发育过程中的功能,通过RT-PCR技术克隆到烟草的类胡萝卜素双加氧裂解酶4基因(NtCCD4),编码区1806 bp,编码601个氨基酸,基因序列提交NCBI,GenBank登录号为JF947192.根据氨基酸组成对NtCCD4基因编码蛋白的疏水性/亲水性、蛋白结构及进化关系等进行预测和分析.结果表明:烟草NtCCD4基因编码的蛋白分子量为65936.3 Da,等电点为6.58,定位在叶绿体膜上,为一个稳定的亲水性蛋白;二级结构预测显示此蛋白结构以无规则卷曲(57.4％)为主,α螺旋(13.31％)和β转角(6.61％)所占比例相对较少;进化分析表明NtCCD4是类胡萝卜素双加氧裂解酶基因( CCDs)家族中的一个成员,与其他物种的CCD4蛋白比较显示NtCCD4编码的蛋白含有多个保守区域,其中4个组氨酸残基是组成蛋白功能域所必须的,它们与Fe2+结合共同组成蛋白酶的活性中心.     

减弱UV-B辐射对烟草（Nicotiana tabacum L.）叶片SOD、POD和CAT活性动态变化影响初探

以云南种植面积较广的烟草品种K326作为供试材料进行盆栽种植,选择云南烟叶主产的玉溪烟区种植烤烟海拔最高的通海县(1806米)为试验点,通过在自然条件分别减弱25%(T1)、50%(T2)和65%(T3)的太阳UV-B辐射,研究同一种植地不同UV-B辐射对烤烟中部叶片发育过程中SOD、POD和CAT活性动态变化的影响.结果表明:T1和T3处理对烤烟SOD活性没有大的影响,但能减轻叶片衰老时的氧化胁迫,而T2处理虽能使烟叶SOD活性在7月22日之前维持稳定的且较低的水平,但之后SOD活性波动较大且高;减弱UV-B辐射没有改变烟叶生长过程中POD活性的上升趋势,但T1和T2处理在8月1日之前稍降低了POD活性,T2处理提高了8月1日～8月15日时段烟叶POD活性,而T3处理的该时段烟叶POD活性不变;减弱UV-B辐射对CAT的活性没有影响.结果说明3种酶中SOD和POD相对较UV-B辐射敏感,在降低75%～80%全光照条件下,烤烟有较宽的低UV-B辐射耐受范围.     

烟草Mlo基因的克隆及其序列特性分析

Mlo基因家族是一类植物抗病的负调控因子,该基因的突变能产生广谱的抗病性。以GenBank公布的水稻Mlo基因序列(登录号:AK099399.1)为信息探针对烟草的EST数据库进行同源搜索,并将获得的同源性高的EST序列进行拼接,最后得到了烟草Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因cDNA片段951 bp,该基因可编码304个氨基酸。采用生物信息学方法预测分析了该基因编码蛋白的一、二级结构,并对其功能进行了预测。结果表明,该烟草Mlo基因编码蛋白包含有一个保守的Tmemb_40结构域,可能是一种类似于植物G蛋白偶联受体的膜结合转运蛋白。