基于芯片数据的烟草qRT-PCR内参基因鉴定与验证

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果的准确性关键在于选择合适的稳定内参基因,而常用持家基因的表达不是恒定不变的,无法满足qRT-PCR准确定量的要求。为发掘烟草中优于传统持家基因的新内参基因,分析了烟草100张基因芯片数据,鉴定了稳定表达的候选内参基因,并利用烟草各个发育时期的RNA样品,通过qRT-PCR实验比较并验证了其表达的稳定性。结果显示,新鉴定的烟草内参基因HSC70-1表达稳定性优于所有的常用持家基因,HSC70-1,L25,EF-1α和HIST2H3A为烟草qRT-PCR实验中的最优内参基因组合,同时使用4个基因进行校正和标准化获得了可靠的定量结果。     

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

miRNA398调控烟草Cu/Zn-SOD基因的表达

模式植物miRNA398可以抑制靶基因Cu/Zn-SOD的表达。为揭示烟草miRNA398的生物学功能,采用荧光定量PCR技术分析了烟草品种CB-1和B37在干旱胁迫条件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的表达量,并预测了烟草miRNA398结合Cu/Zn-SOD基因的位点。结果表明:烟草miRNA398与Cu/Zn-SOD基因5非翻译区的21个碱基序列互补,从而抑制该基因的表达;在干旱胁迫条件下,CB-1的miRNA398表达水平上升,B37的miRNA398表达水平下降,Cu/Zn-SOD基因表现出与miRNA398相反的表达趋势,说明抗旱能力存在差异的两个品种中miRNA398均可抑制Cu/Zn-SOD基因表达,并且对干旱胁迫响应具有两种不同的方式。     

烟草GA代谢相关基因ga1和ga2的克隆和表达分析

为了解赤霉素（gibberellic acids, GA）在烟草生长发育中的作用,本研究利用同源克隆和RACE技术分离了3个烟草种GA代谢相关基因ga1和ga2的6条序列,对其进行了序列比对和进化分析;并利用荧光定量表达分析研究了其在林烟草和普通烟草中的表达谱。结果表明,相关基因在烟草属和茄科作物中保守性很高;普通烟草中克隆的ga1和ga2可能起源于绒毛状烟草。表达分析表明,ga1和ga2在林烟草生长发育早期和茎伸长期分别在叶和茎中的表达量显著高于其他组织。     

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

  背景和目的  近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。  方法  采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。  结果  三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。  结论  我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。      

油菜种子含油量相关的脂肪酶基因BnSDP1克隆与表达分析

通过电子延伸和RACE（cDNA末端快速扩增）克隆得到一个与油菜种子含油量相关的脂肪酶基因,命名为BnSDP1,其开放阅读框为2 472bp,编码分子量为92kD的蛋白,预测等电点为6.75,具有保守的patatin结构域,跨膜域位于N端和中间,序列分析显示BnSDP1拥有GXSXG脂肪酶的基本特征序列GSSVG。利用RT-PCR技术分析发现,在种子发育的成熟期（即脱水期）,BnSDP1在低油品系种子中的转录水平高于高油品系,在根、茎、叶、花中均有表达,但在根和叶片中表达量高,在根中尤其显著,且受蔗糖诱导上调表达。     

特异性siRNA质粒的构建及其抑制癌细胞中mcl-1表达的研究

本文构建了靶向mcl-l基因构建的特异性siRNA重组质粒,在细胞水平检测的其抑制效果,并筛选出能高效抑制mcl-l基因表达的siRNA重组质粒,针对mcl-1的特异性siRNA重组质粒,将其转染到人肝癌细胞HepG2,用Rt-PCR(实时荧光定量PCR)方法和WesternBlot方法分别检测转染前后mcl-1mRNA水平和Mcl-1蛋白表达水平,比较对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1的抑制效果。结果表明,Rt-PCR结果显示对应不同位点的两个siRNA重组质粒对mcl-1均可降低mcl-1mRNA水平,最大抑制效率达70.0%,远高于作为对照非相关组;Western-Blot结果显示转染特异性siRNA重组质粒后Mcl-1蛋白表达受到抑制,最大抑制率为44.2%。合理设计的特异性siRNA重组质粒可大幅度下调mcl-1mRNA水平,能有效抑制Mcl-1蛋白表达。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

烟草DGAT3基因响应冷胁迫应答的功能研究

二脂酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）是催化三脂酰甘油（TAG）合成途径的关键酶,在植物生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的作用。本研究从普通烟草品种K326中克隆得到NtDGAT3基因,利用荧光定量PCR技术分析不同组织中和低温胁迫下NtDGAT3的表达规律。同时,利用CRISPR/Cas9技术制作NtDGAT3敲除植株,对其耐冷性进行了分析。结果表明,NtDGAT3在烟草根、茎、叶中均有表达,且叶部表达量最高;NtDGAT3受冷胁迫强烈诱导,说明该基因可能对冷胁迫有响应。低温处理试验结果表明,敲除突变体ntdgat3对冷敏感,突变体叶片离子渗漏率及丙二醛含量的变化幅度显著高于野生型烟草;在ntdgat3中,膜脂代谢关键基因PLDα1的表达水平显著高于野生型烟草,而PLDδ的表达水平显著低于野生型烟草。以上结果表明,NtDGAT3基因通过PLDα1和PLDδ的表达参与调节植物低温响应。     

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析

脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶,在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定,并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因,其中12个LOX基因被锚定在染色体上。系统进化分析表明,普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类。共线性分析表明,烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对,并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式。表达模式分析发现,普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性,并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导。因此,普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。     

烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）基因家族的克隆及组织表达谱分析

运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术从烟草（Nicotiana tabacum）中克隆了4个CPI基因的全长cDNA序列,分别命名为NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4, GenBank登陆号分别为KF057988、KF057989、KF057990和KF057991。基因序列分析表明4个基因分别编码98、98、120和123个氨基酸残基的蛋白质,都具有CPI反应位点的保守基序GG、QXVXQ和A/PW,同时具有植物CPI所特有的LARFAV基序,其中NtCPI3和NtCPI4的N端还包含一段27个氨基酸残基组成的信号肽。实时荧光定量PCR试验表明,4个基因的组织表达谱很广,在根、茎、叶和芽组织中都有表达。这些结果为进一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物中的生理功能奠定了基础。      

烟草茄尼醇生物合成基因

茄尼醇不仅是合成辅酶Q10和维生素K2等泛醌类药物的重要中间体,而且是卷烟烟气多环芳烃的重要前体物,对卷烟安全性有较大影响。综述了烟草茄尼醇生物合成途径及其关键酶基因的研究进展,展望了其在烟草医药价值开发和低危害烟草品种培育中的应用潜力。     

四川和河南烤烟叶片番茄红素β环化酶基因的表达分析

为了探明四川和河南烤烟烟叶类胡萝卜素差异的分子机理,揭示同一品种烤烟在四川和河南产生不同香气风格的机理,采用半定量RT-PCR和Northern杂交方法检测了四川和河南烤烟现蕾期叶片中类胡萝卜素合成关键基因番茄红素β环化酶基因(Lyc-β)的表达水平,并用高效液相色谱法测定了同期烟叶中类胡萝卜素的含量。结果显示,四川烤烟现蕾期叶片中Lyc-β基因的表达水平显著高于河南的;四川烟叶的叶黄素和β胡萝卜素含量显著高于河南的。     

烟草CYP71D亚家族的生物信息学分析

细胞色素P450（CYP450）是一类超基因家族编码的多功能氧化酶,在生物合成、代谢解毒及植物防御方面具有重要作用。其中CYP71D属于CYP450的一个亚家族,主要在次生代谢物合成和病虫害防御方面起作用。为了更好地了解烟草CYP71D亚家族基因特征和功能,本研究利用生物信息学分析手段及烟草转录组数据,对CYP71D亚家族基因的结构和表达等进行了分析。结果发现,在烟草中共有42个CYP71D亚家族成员,各成员在染色体上并非均匀分布,其氨基酸长度和等电点差异较大,但基因结构、保守结构域数目和分布高度一致;二级结构分析表明,烟草CYP71D亚家族成员具备P450蛋白特征结构域;基因表达模式分析显示,多数CYP71D基因在根、叶、花中特异表达,大部分基因参与了IAA激素、黑胫病、温度等逆境胁迫反应。这为烟草CYP71D亚家族基因功能的深入研究及烟草抗逆品种的培育奠定了基础。     

普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物的多种生命进程中发挥着重要作用。为解析烟草中Dof家族成员在生长发育过程中的潜在作用,本研究利用比较基因组学、进化分析、共线性分析等方法解析烟草中的Dof家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在烟草基因组中共鉴定到69个Dof转录因子,其Dof功能域在进化上十分保守,根据系统进化分析结果将其划分为9个亚家族。共线性分析表明,烟草中的16个Dof基因与拟南芥17个Dof基因有27个共线性基因对,同时,25个Nt Dof基因被检测到存在17个全基因组复制对,表明复制事件在烟草Dof基因家族的扩张中起关键作用。此外,表达模式分析表明Nt Dof基因的表达存在明显的组织特异性,其中NtDof05和NtDof28基因可能与根系生长发育有关。本研究对烟草基因组中的Dof转录因子进行了系统的鉴定和分析,为烟草Dof转录因子家族成员的功能研究奠定了基础。     

烟草Hsp70基因家族的鉴定及NtHsp70Chl基因的表达分析

为探明烟草热激蛋白70（Hsp70）基因家族的特征及烟叶主脉中NtHsp70Chl基因在烘烤条件下的表达模式,对Hsp70基因家族进行了亚细胞定位、系统进化、基因结构、染色体定位,并对NtHsp70Chl基因进行了烘烤条件下实时荧光定量表达PCR分析。结果表明,烟草基因组中Hsp70基因家族共有61个成员,蛋白序列长度不等,等电点在4.52~9.75范围内,各成员蛋白分别定位于细胞质、内质网、细胞外基质、叶绿体和线粒体中;烟草Hsp70基因家族分为6组,定位于叶绿体的成员均存在Ⅵ-a亚组;61个NtHsp70基因分布于18条染色体上,经亚细胞定位于叶绿体的基因分别位于6、17和19号染色体上;烟草Hsp70家族中具有10个基因重复和5个旁系同源基因;经RT-qPCR检测分析,定位于烟草叶绿体中的NtHsp70Chl基因对高温诱导的敏感性较弱。本研究为深入研究烟草Hsp70的功能奠定了基础。     

烟草绿原酸合成关键基因NtHQT1的克隆及表达分析

绿原酸(Chlorogenic acid,CGA)是烟叶中含量最高的多酚类物质,羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶(Hydroxycinnamoyl-Co A quinate hydroxycinnamoyl transferase,HQT)是植物绿原酸合成代谢途径中的关键酶。为研究HQT基因在烟草绿原酸合成中的作用机制,通过同源克隆技术从烟草中克隆到一个新的HQT基因,命名为Nt HQT1。生物信息学和激素处理后基因表达模式分析结果表明:Nt HQT1 c DNA全长1 305 bp,编码435个氨基酸,Nt HQT1定位在细胞质中,属于疏水性蛋白,其二级结构主要是螺旋和无规则卷曲;茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,Me JA)、生长素(3-Indoleacetic acid,IAA)、独角金内酯类似物(GR24)、细胞分裂素(6-Benzylaminopurin,6-BA)和赤霉素(Gibberellic acid,GA)能明显上调Nt HQT1基因的表达,脱落酸(Abscisic acid,ABA)对基因表达没有明显作用,预示Nt HQT1基因在烟草生长发育和抗病等生物学过程中发挥重要作用。      

烟草组织蛋白酶B基因的结构特征分析及mRNA表达

为了明确烟草中组织蛋白酶B基因的功能,对烟草组织蛋白酶B基因(NbCathB)进行了序列分析.该基因ORF长951bp,编码316个氨基酸.该基因蛋白质的预测分子量为35.2 kD,等电点为6.14.对NbCathB的基因结构分析显示,该基因具有8个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则.比较NbCathB和AtCathB基因,显示两者编码氨基酸序列一致性为61％.通过SMART软件分析,NbCathB和AtCathB基因的结构域很相似.在上清液、菌体、菌液以及水4种处理烟叶中的表达谱鉴定显示,在喷施MP制剂(巨大芽孢杆菌)菌体和菌液的烟叶中NbCathB的表达量明显高于在喷施MP制剂上清液的烟叶中的表达量,而在喷施水的烟叶中的表达量最低.说明NbCathB很可能发挥了AtCathB相同的作用.     

烟草过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达特征分析

基于GeneBank中已有的植物Catalase 1（CAT1）基因序列设计烟草CAT1的特异性引物,通过RT-PCR扩增克隆获得Nicotiana tabacum var. NC89 CAT1全长mRNA序列,可编码492个氨基酸残基。遗传进化分析显示NC89 CAT1中与N .benthamiana CAT1基因亲缘关系最近。利用real-time RT-PCR技术对CAT1基因在烟草中的组织表达特异性和烟草NC89应对生物和非生物胁迫的表达差异进行了分析。结果表明CAT1基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中均有表达,其中在根部表达量最低,在叶中相对表达量最高。生物和非生物胁迫处理烟株,其CAT1诱导表达分析显示,机械损伤、渗透压、低温和高温、干旱、和感染TMV CAT1表达量上调,紫外胁迫下表达量下调。上述研究表明烟草CAT1基因可能参与了植物的生长发育、应对非生物和生物胁迫的过程。