口蹄疫病毒多价DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)多价DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法以复合多表位表达盒OAAT及AsiaⅠ型FMDV的P1-2A-3C基因为基础,构建FMDV多价DNA疫苗pIRES-OAAT-P1-2A-3C,并用间接免疫荧光(IFA)方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。进一步进行小鼠免疫试验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,ELISPOT检测小鼠脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌水平,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群数量,淋巴细胞转化试验检测特异性淋巴细胞增殖水平。结果所构建的FMDV多价DNA疫苗在HeLa细胞中获得了正确表达。免疫小鼠后,血清特异性抗体水平、脾淋巴单细胞IFN-γ的分泌、脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量及特异性淋巴细胞增殖水平均显著提高。结论已成功构建了FMDV多价DNA疫苗,并诱导小鼠产生了特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

重组口蹄疫鸡痘病毒vUTAL3CP1的构建及其遗传稳定性和免疫原性

目的构建重组口蹄疫鸡痘病毒,并检测其遗传稳定性和免疫原性。方法将口蹄疫病毒(FMDV)的衣壳蛋白前体P1-2A和蛋白酶3C基因插入到鸡痘病毒表达载体中,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL3CP1,并与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU加压筛选获得重组鸡痘病毒vUTAL3CP1。重组病毒在CEF中连续传30代,分别进行毒力和基因检测,并免疫BALB/c小鼠,检测特异性抗体和中和抗体。结果重组鸡痘病毒经RT-PCR可扩增出目的基因;特异性荧光抗体反应呈阳性;在CEF中连续传30代,毒力稳定,基因未发生缺失和变异;免疫小鼠能产生较高水平的FMDV特异性抗体和中和抗体。结论已成功构建重组口蹄疫鸡痘病毒,且具有良好的遗传稳定性和免疫原性。     

水泡性口炎病毒保护性抗原基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

目的构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性。方法利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基因,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测质粒的表达,用核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达,质粒免疫小鼠后,可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高,并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体。结论该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗。     

共表达口蹄疫病毒O型P1-2A-IL-18基因和Asia I型P1-2A-3C基因重组鸡痘病毒的构建

目的构建共表达口蹄疫病毒(FWDV)O型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。方法将酶切得到的FWDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因克隆至鸡痘病毒表达载体pUTAL上,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18,与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU3次加压筛选,挑选出单克隆重组病毒株,进行RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)鉴定。结果重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-P1-2A-3C-P1-2A-IL-18经双酶切鉴定证明构建正确。经RT-PCR和IFA鉴定,证明所筛选的重组鸡痘病毒在CEF中能正确表达P1-2A-3C-P1-2A-IL-18基因盒。结论已成功构建了共表达FMDVO型P1-2A-IL-18基因和AsiaI型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒。     

人黏蛋白1串联重复区DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答

目的观察人黏蛋白1串联重复区(MUC1 VNTR)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的体液及细胞免疫应答。方法将含有33个黏蛋白1重复区序列(33m)的重组质粒pVR1012-33m,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,并加强免疫2次,每次100μg,间隔2周,分别以空载体pVR1012和生理盐水为对照。末次免疫后取小鼠血清及脾淋巴细胞,Western blot检测血清抗体特异性,LDH法检测CTL反应活性,MTS/PMS法检测脾淋巴细胞增殖活性。结果重组质粒免疫组小鼠血清中检出了MUC1 VNTR抗原特异性抗体。用重组质粒pVR1012-33m免疫BALB/c小鼠后,在效靶比为100:1和33:1时,可显著地诱导特异性CTL应答。在MUC1 VNTR抗原肽的刺激下,免疫小鼠脾淋巴细胞得到增殖,与空载体和生理盐水对照组相比,差异均有显著意义。结论DNA疫苗pVR1012-33m在BALB/c小鼠体内可诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答,为预防、治疗性MUC1 VNTR疫苗的研制提供了一定的实验依据。     

转人HLA-A2基因小鼠对adr亚型重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)的免疫应答

目的对汉逊酵母表达的adr亚型重组乙型肝炎(简称乙肝)疫苗(adr疫苗)进行免疫学特性与功能学研究。方法采用adr疫苗与酿酒酵母表达的重组乙肝疫苗(adw疫苗)免疫转人HLA-A2基因小鼠,免疫剂量2μg/0.2 ml,于初免3周后进行第2次免疫。于第2次免疫1周后,采血,分离血清,经ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体水平。同时取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用HLA-A2/WLSLLVPFV五聚体荧光标记流式细胞术分析细胞中特异性抗乙肝病毒表位的CTL比例。结果 adr疫苗与adw疫苗均可诱导转基因小鼠产生抗乙肝表面抗原抗体,且抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),2种疫苗对转基因小鼠的体液免疫应答的增强作用相似;adr疫苗诱导的乙肝表面抗原特异性CTL应答作用较adw疫苗更明显(P<0.05)。结论 adr重组乙肝疫苗(汉逊酵母)诱导转基因小鼠的体液免疫应答作用与现有adw疫苗相似,但其诱导机体产生细胞免疫应答的能力更显著,可能具有更加良好的预防HBV感染作用和前景。     

重组乙型肝炎痘病毒载体疫苗与DNA疫苗免疫原性比较

目的比较重组乙型肝炎痘病毒载体疫苗与DNA疫苗的免疫原性。方法用载体疫苗和DNA疫苗分别免疫BALB/c小鼠,采用ELISA和ELISPOT法检测小鼠的体液免疫和细胞免疫水平。结果两种疫苗的血清抗体水平分别为135和104 mIU/ml,百万淋巴细胞中SFC数目分别为550和314,载体疫苗均优于DNA疫苗。结论重组乙型肝炎痘病毒载体疫苗较DNA疫苗具有更高的免疫原性。     

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。     

Asia 1型FMDV复合多表位亚单位疫苗在毕赤酵母中的表达及其免疫原性

目的构建以霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)为分子佐剂的Asia1型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)复合多表位亚单位疫苗,在毕赤酵母中进行表达,并评价其免疫原性。方法构建毕赤酵母表达质粒pPIC9K-P1/2A-CTB-TEpi,转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,表达产物经硫酸铵沉淀法纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。将纯化的P1/2A-CTB-TEpi蛋白和FMD灭活疫苗分别免疫BALB/c小鼠,以注射PBS作为对照,分别于0、21d各免疫1次。每周尾静脉采血,分离血清,ELISA法检测血清抗体水平;第2次免疫后10d,处死小鼠,分离脾脏淋巴细胞,进行淋巴细胞增殖试验和IFNγELISPOT检测。结果目的蛋白在毕赤酵母中经诱导表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为82600(P1/2A)和40500(CTB-TEpi)处可见2条特异性蛋白表达条带,占上清液中可溶蛋白的21%。纯化后的目的蛋白P1/2A和CTB-TEpi的比例约为1∶2,且具有良好的反应原性。P1/2A-CTB-TEpi蛋白免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其特异性血清抗体水平与灭活疫苗组差异无统计学意义(P>0.05),而淋巴细胞增殖水平和IFNγ分泌水平显著高于灭活疫苗组(P<0.01)。结论构建了以CTB为分子佐剂的Asia1型FMDV复合多表位亚单位疫苗,其免疫原性良好,为FMD多表位疫苗和亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

HIV-2 Gp105基因重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的　研制预防HIV -2的重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法　将HIV -2Gp10 5基因插入鸡痘病毒转移载体pUTA2复合启动子的下游 ,构建鸡痘病毒转移载体pUTA2 Gp10 5。将该重组质粒与鸡痘病毒 (FPV) 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,进行同源重组。通过 3次BrdU加压筛选 ,以PCR、RT PCR、IFA和Westernblot鉴定重组病毒。结果　从重组鸡痘病毒的基因组和总RNA中能扩增出大小为 6 5 3bp的目的基因 ;感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应 ;表达产物与人HIV- 2血清发生阳性反应 ,目的蛋白相对分子质量约为10 5 0 0 0。结论　成功获得 1株重组鸡痘病毒 ,可正确表达HIV 2Gp10 5基因。     

Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。     

重组鸡痘病毒对豚鼠的生物安全性

目的检测重组鸡痘病毒在妊娠豚鼠及其子代豚鼠体内的安全性。方法重组鸡痘病毒以正常剂量和超大剂量同时免疫妊娠豚鼠和子代豚鼠,通过临床观察、病理组织学、PCR等方法,检测重组鸡痘病毒对妊娠豚鼠的毒性和子代豚鼠生长的影响以及子代豚鼠的病毒DNA残留。结果临床观察和病理组织学检测表明在整个实验期间,免疫重组鸡痘病毒的妊娠豚鼠精神状态、饮水、采食等临床表现一切正常,未表现出临床症状和不良反应,未造成早产、流产、死胎、弱胎;用正常和超大剂量免疫重组鸡痘病毒的子代豚鼠均未出现任何临床症状,内脏器官未见明显的病理变化,且未检测到病毒DNA。结论构建的重组鸡痘病毒生物安全性好,对妊娠豚鼠和子代豚鼠无安全威胁。     

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。方法用BamHⅠ和HindⅢ双酶切含有HCVC区、E2区模拟表位和NS3~NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达。以100μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果。结果所构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达。该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组。结论已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

中国流行株HIV-1Gag蛋白在重组鸡痘病毒的表达及鉴定

目的 以鸡痘病毒为载体,表达ＨＩＶ－１　Ｇａｇ蛋白,进而研制ＡＩＤＳ疫苗。方法 以鸡痘病毒２８２Ｅ４株 非必需区ＴＫ基因为侧翼,插入ＶＶ突变型Ｐ７．５串联启动子和牛痘病毒Ａ包涵体晚期启动子与２０个串联的突变型 早期痘苗病毒Ｐ７．５启动子组成复合启动子及ＬａｃＺ报告基因构建重组表达质粒ｐＵＴＡＬ。在ＡＴ１－Ｐ７．５复合启动子 下游,插入编码中国流行株 ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因（Ｂ亚型）,构建了重组表达质粒ｐＵＴＡＬ－Ｇａｇ。重组质粒Ｇａｇ与ＦＰＶ共 转染ＣＥＦ细胞,进行同源重组。通过ＢＵｄＲ加压筛选,Ｘ－ｇａｌ染色,获得重组鸡痘病毒ｖＵＴＡＬＧ,用于感染ＢＨＫ细胞 并免疫小鼠。结果　经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测,重组病毒表达了Ｇａｇ蛋白相对分子质量分别为５５０００、４８０００、２４０００和 １７０００,为Ｇａｇ蛋白的Ｐ５５、Ｐ４８、Ｐ２４和Ｐ１７蛋白。重组病毒免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。结论　所重组的病毒 成功地表达了目的蛋白并进行了正确加工。