聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

目的　建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEG rhIFNα2b)的质量检测方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统 ,以CPE法测定干扰素的生物学活性 ,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,反向高效液相法 (RP HPLC)测定纯度 ,溴化氰裂解 SDS PAGE法测定肽图 ,等电聚焦电泳法测定等电点 ,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果　聚乙二醇化重组人干扰素α2b的比活为 6 . 0× 10 6～ 10 . 0× 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量约为 6 2 6 0 0 ,等电点在 5 . 2 0～ 6. 5 5之间 ,紫外最大吸收峰约在 2 78nm波长处。结论　所建立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素α2b质量。     

不同分子量聚乙二醇单修饰重组人干扰素a-2a

利用N-羟基琥珀酰亚胺活化制备不同分子量的聚乙二醇修饰剂(NHS-mPEG，分子量5000, 10000, 20000)，考察三者水解动力学性质的差异，结合正交实验确定了不同分子量修饰剂制备单条PEG链修饰重组人干扰素a-2a(rhIFN-a-2a)的最佳反应条件，用离子交换法对产物进行分离纯化. 研究了不同分子量聚乙二醇干扰素结合物的体外活性，比较其蛋白收率. 实验结果表明，修饰剂分子量增大，应选择蛋白与修饰剂的反应活性高的修饰反应条件，体外活性虽然降低，但同时单修饰聚乙二醇干扰素结合物收率更高，产品质量更易控制.     

重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

目的构建重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)分泌表达质粒,进行原核表达,并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STⅡ信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因,与pBR322载体连接,构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将目的基因亚克隆至pACYC184载体,构建重组表达质粒pAC-hGH,进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGH转化至感受态大肠埃希菌W3110中,构建重组工程菌,经诱导表达后进行DEAE-Sepharose FF纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定,构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22 000的目的条带,菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上,分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致,比活性大于3.0 IU/mg。结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒,且获得了纯度及活性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素-α1b条件的优化

目的对聚乙二醇(PEG)衍生物化学修饰重组人干扰素-α1b(rhIFN-α1b)的条件进行优化。方法以3种不同的第2代PEG衍生物对rhIFN-α1b进行修饰,SDS-PAGE分析PEG及修饰产物的表观相对分子质量。对反应pH值、温度、时间、修饰剂用量等修饰条件进行优化,并对修饰产物进行初步分离纯化和活性检测。结果PEG的电泳表观相对分子质量大于其理论值;PEG20000的修饰率(92.1%)高于PEG5000和PEG10000;修饰剂用量和pH值是主要影响因素,最佳pH为9.0,rhIFN-αlb与PEG20000的最佳摩尔比为1∶10,时间和温度影响甚微。单点修饰产物保留了14.4%的体外活性,多点修饰产物无活性。结论选择了合适的PEG衍生物并优化了修饰条件,为进一步深入研究奠定了基础。     

聚乙二醇化重组人Cu,Zn-SOD改构体制备工艺的优化及其半衰期测定

目的优化聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化重组人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)改构体(rmhCu,Zn-SOD)的制备工艺,以期延长其在体内的半衰期。方法以相对分子质量5 000的甲氧基聚乙二醇乙酸-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-SPA)作为修饰剂,对rmhCu,Zn-SOD蛋白进行化学修饰,并对mPEG-SPA与rmhCu,Zn-SOD的摩尔比、反应缓冲液、反应温度、反应方式及反应时间进行优化;利用硫酸铵沉淀、凝胶过滤色谱法对PEG化rmhCu,Zn-SOD进行分离纯化,并检测其在小鼠体内的半衰期。结果 PEG化rmhCu,Zn-SOD的最佳制备工艺为mPEG-SPA与rmhCu,Zn-SOD的摩尔比1.5∶1,缓冲液为pH 8.5的磷酸盐缓冲液,反应液混匀后4℃静置反应1 h;纯化的修饰产物的纯度约为90%,残余酶活力为(84.3±2.3)%,蛋白修饰率为(65.4±1.9)%;与未修饰的rmhCu,Zn-SOD相比,PEG化rmhCu,Zn-SOD的半衰期延长了约7倍。结论优化了PEG化rmhCu,Zn-SOD的制备工艺;PEG化修饰有效延长了该改构体蛋白在体内的半衰期。     

聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化

采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰重组人粒细胞集落刺激因子rhG CSF，考察了各因素对蛋白质平均修饰度及体外生物活性的影响，并对修饰产物的稳定保存条件进行了初步探讨. 通过四因素四水平正交法和单因素实验结合，优化修饰条件为：PEG与G CSF摩尔比为25:1, pH 7.6的硼酸盐缓冲环境，反应时间40 min，反应温度22℃. 在此条件下，PEG-G-CSF的平均修饰度为50%，活性可保留40%左右. 研究还发现，不同的添加剂影响PEG-G-CSF的保存稳定性，人血清白蛋白和甘露醇是两种效果最好的保护剂，在它们的存在下，PEG-G-CSF溶液在4℃放置一个月后活性保留92%，三个月后保留51%.     

基因重组人生长激素治疗生长激素缺乏症疗效观察

目的探讨国产重组人生长激素治疗儿童生长激素缺乏症28例的临床疗效。方法GHD患儿28例,予国产r-hGH每晚皮下注射,0.1IU/kg,疗程6个月。结果治疗6个月后,28例患儿生长速率由(3.2±0.5)cm/年增至(12.3±0.3)cm/年,身高由(117.4±11.3)cm/年增至(123.5±12.3)cm/年,骨龄由(6.3±1.8)岁增至(6.8±1.6)岁。结论国产r-hGH是治疗GHD安全、有效的药物之一,值得临床推广应用。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质

目的制备聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素α1b(rhIFNα1b),并分析其部分性质。方法采用PEG修饰rhIFNα1b,通过离子交换层析分离纯化修饰混合物,单点修饰产物经超滤浓缩后,经Lowry法检测蛋白的浓度,SDS-PAGE和RP-HPLC检测蛋白的纯度,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点,质谱法检测蛋白的相对分子质量,细胞病变抑制法检测蛋白的体外活性,ELISA法检测蛋白的抗原性。结果单点修饰产物的蛋白得率为33%;SDS-PAGE分析纯度为96.1%,RP-HPLC分析纯度为98.1%;等电点为6.22;相对分子质量为39946;比活为1.28×106IU/mg,活性保留率为14.4%;抗原性至少降至原来的1/625。结论制备的单点修饰rhIFNα1b药学性质获得改善,有望开发为安全、长效的新型干扰素。     

重组人生长激素给药系统的研究进展

重组人生长激素（rhGH）是治疗各种生长激素缺乏症及并发症的首选药物,但临床上需长期频繁注射给药,实现rhGH长效化和改变给药途径可显著提高患者依从性,具有重要的研究价值。本文针对近年来rhGH长效化制剂和非注射给药途径的类型、有效性及开发现状进行了综述,主要介绍了利用化学修饰、构建融合蛋白、构建缓释微球等rhGH长效化方法以及经皮给药、肺部给药、鼻腔黏膜给药等rhGH非注射给药途径的研究现状和最新进展,分析了各类rhGH给药系统在应用方面的潜在问题,以期使读者对该领域的研究状况有更全面、更清楚的了解;并指出了该研究领域未来的发展方向,提出了将rhGH长效化与非注射给药途径合理结合应是将来实现rhGH高效递送的重要研究方向,以期为进一步开发安全有效的rhGH新型给药系统提供参考。     

重组人干扰素γ的分子结构及其生物活性

目的 了解重组人干扰素γ的分子结构及其生物活性。方法 采用细胞病变抑制法，以日本干扰素γ参考品为标准，计算国际单位。以4种不同方法检测相对分子质量。结果 比活性≥3．0×107 IU/mg蛋白，相对分子质量低于理论值16900。氨基酸分析结果只有129个氨基酸，少于应有数目。N端氨基酸序列分析结果，15－19个氨基酸与理论序列相符。结论 重组人干扰素γ C末端氨基酸有缺失，但不影响其生物活性。     

重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析

目的对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子(rhALR)进行分离纯化及生物学活性分析。方法以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30780·522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致。Western blot证实rhALR正确表达,等电点5·85~6·85,氨基酸含量与理论值基本符合。动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性。结论经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性。     

重组人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10),并检测其生物学活性。方法将IL-10基因重组到质粒pET11c中,转化BL21(DE),提取质粒,经酶切鉴定和测序分析;在25℃用低浓度的IPTG诱导表达,对包涵体IL-10稀释复性;经ELISA检测其含量,MC/9细胞增殖法检测其生物学活性。结果工程菌IL-10/pET11c/BL21诱导表达的目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Westernblot鉴定证实为IL-10蛋白,两种形式的IL-10均具有一定的生物学活性。结论已成功地在大肠杆菌中表达了IL-10,为进一步纯化和制备IL-10的基因工程药物打下了基础。     

重组人促红素体内、体外生物学活性差异成因分析

目的分析造成重组人促红素(rHuEPO)体内、体外生物学活性差异的原因。方法按《中国药典》三部(2005版)方法检测rHuEPO样品体内、体外生物学活性,并通过等电聚焦电泳分析、唾液酸含量、纯度、N-糖链糖基化和相对分子质量检测,探讨样品体内、体外生物学活性产生差异的原因。结果体内、体外生物学活性有差异的rHuEPO样品中,存在糖链末端N-乙酰神经氨酸残基不完整的rHuEPO成分。纯度、N-糖链糖基化和相对分子质量检测结果未见异常。结论为提高rHuEPO产品质量,应在生产过程中有效去除N-乙酰神经氨酸残基不完整的rHuEPO。     

胃蛋白酶在体外对转移因子生化特性及生物活性的影响

当胃蛋白酶与猪脾转移因子在体外模拟胃酸（pH2．0）的情况下，于37℃水浴中作用1h及2h后，其紫外（A254nm）吸收值及对经45℃处理1h的T淋巴细胞EaRFC和EtRFC形成率与对照PS－TF之间均无显著差异（p＞0．05）。200nm～300nm扫描曲线表明，PS－TF经胃蛋白酶作用2h后，在230nm以下主要由肽键形成的吸收峰明显下降。表明胃蛋白酶对PS－TF中多肽链某些部分的水解与PS－TF的生物活性无关。     

重组人纽兰格林生物学活性检测方法及质控标准

目的　研究重组人纽兰格林生物学活性检测方法 ,并制定其质量控制标准。方法　采用激酶受体活化的酶联免疫吸附试验 (KIRA ELISA) ,通过优化细胞浓度、样品稀释梯度、药物刺激时间及细胞裂解方法等建立定量测定重组人纽兰格林体外生物学活性的方法 ,同时建立了一套完整可行的质量控制标准。结果　重组人纽兰格林刺激MCF 7细胞表面ErbB2 ErbB3分子磷酸化的反应存在量 效关系 ,相关系数大于 0 98,原液的平均比活性为 85 10U mg± 115 0U mg。并对原液设立肽图、纯度等检测项目 ,对成品设立热原质试验、鉴别试验等检测项目。结论　KIRA ELISA可用于定量检测重组人纽兰格林的体外生物学活性 ,结果准确可靠 ,重复性好 ;建立的方法和标准可以有效控制重组人纽兰格林制品的质量。     

重组小纤溶酶的制备及其生物学活性

目的制备重组小纤溶酶,并检测其生物学活性。方法将重组质粒pET11a-miniPlg转化E.coli BL21(DE3),进行诱导表达。收获菌体,提取包涵体,经复性、层析纯化、尿激酶激活,制备小纤溶酶。进行初步理化鉴定后,采用生色底物法测定其体外活性,采用动物模型进行体内溶栓试验,并与重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)进行比较。结果小纤溶酶的表达量约占菌体总蛋白的30%～35%,纯化收率约为15%,得率为4.93mg/g菌体湿重,相对分子质量为38527,N-、C-端氨基酸序列与理论值一致。制备的小纤溶酶比活性为115IU/mg,动物模型溶栓试验中表现出良好的溶栓效果,对纤溶系统和凝血系统影响轻微。结论所制备的重组小纤溶酶具有良好的生物学活性,溶栓效果及安全性均优于rt-PA。     

重组分泌型人生长激素的纯化

rh GH工程菌 W310 0发酵培养后 ,经低渗裂解、阴离子交换柱层析、疏水层析、分子筛层析 ,得到纯化的人生长激素 ,纯度为 97%以上 ,比活大于 2 .5 IU / mg     

抗肝癌hdsFv-hEDN重组免疫毒素的表达及生物学活性

目的制备对人肝癌细胞具有特异性杀伤活性的抗肝癌重组免疫毒素。方法利用大肠杆菌系统表达抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素。表达产物经NiNTA亲和层析纯化后,进行特异性杀伤活性检测。结果抗肝癌hdsFvhEDN重组免疫毒素以可溶性形式表达于大肠杆菌培养上清中,并获得有效纯化。ELISA法检测证实其具有与相应抗原特异性结合的活性。细胞毒试验表明对肝癌细胞具有杀伤作用,而对正常肝细胞无损伤。结论已成功地制备了具有特异性结合和杀伤活性的抗肝癌hdsFvhEDN基因重组免疫毒素,为其进一步应用奠定基础。     

鱼藤酮肟氨基羧酸酯的合成、表征及生物活性

以鱼藤酮为原料,经肟化、酯化反应合成了3种鱼藤酮肟氨基甲酸酯类化合物,并用1HNMR对其结构进行了表征。杀虫和抑菌活性测试实验表明,制备的新型鱼藤酮类衍生物具有较高生物活性:N-环己基氨基甲酸鱼藤酮肟酯(Ⅲb)对粘虫(1.00 g/L)的致死率为68.3%,对白粉病菌(0.50 g/L)的抑制率为60.0%。