荔枝果肉苯丙氨酸解氨酶特性的研究

研究了荔枝果肉中苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL）的酶学特性。荔枝PAL动力学曲线并不遵循米氏方程,其最适底物浓度为2 mmol/L。在硼砂-硼酸缓冲液中,荔枝PAL的最适反应p H为8.7。PAL不耐酸碱,尤其不耐酸。荔枝PAL的最适反应温度为45℃,高于75℃则易于钝化,具有较强的耐热性。L-酪氨酸和L-半胱氨酸对荔枝PAL均有明显的抑制作用;金属离子中,Fe2+和Fe3+对荔枝PAL活性具有明显的促进作用,而Ca2+、Cu2+、Co2+、Ag+离子则对其活性有明显的抑制作用。      

大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定

利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。     

鲜切果蔬苯丙烷代谢的研究进展

新鲜果蔬经切割处理后,生理代谢发生紊乱,产品品质大大降低。同时,果蔬机体产生积极的应对反应,通过诱导苯丙烷代谢途径中防御酶活性的提高和多酚、黄酮、木质素等的积累,对机械胁迫起到防御作用。本文通过综述切割后果蔬苯丙烷代谢关键酶以及主要中间产物和最终产物的变化,讨论切割对果蔬苯丙烷代谢的促进作用。      

霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及基本性质的研究

对霍山石斛（Dendrobium huoshanense C·Z·Tang et S·J·Cheng）中的苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase,PAL EC·4·3·1·5）进行了部分分离纯化和性质研究,取组织培养试管苗经过冰浴研磨、硫酸铵分级沉淀、DE-52阴离子交换层析,分离纯化苯丙氨酸解氨酶。经过测定,苯丙氨酸解氨酶的纯化倍数为2·33,蛋白质得率0·41%,酶得率1%。霍山石斛苯丙氨酸解氨酶在硼酸缓冲液中最适pH为8·4,PAL最适反应温度为45℃。霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的最适底物浓度为2mmol/L,有两个Km值,即Km1为0·4425×10-3mol/L,Km2为0·847×10-4mol/L。      

霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及基本性质的研究

对霍山石斛(Detrdrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)中的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL EC.4.3.1.5)进行了部分分离纯化和性质研究,取组织培养试管苗经过冰浴研磨、硫酸铵分级沉淀、DE-52阴离子交换层析,分离纯化苯丙氨酸解氨酶.经过测定,苯丙氨酸解氨酶的纯化倍数为2.33,蛋白质得率0.41%,酶得率1%.霍山石斛苯丙氨酸解氨酶在硼酸缓冲液中最适PH为8.4,PAL最适反应温度为45℃.霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的最适底物浓度为2mmol/L,有两个Km值,即Km1为0.4425×10-2mol/L,Km2为0.847×10-4mol/L.     

明绿豆苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质初步研究

为了研究明绿豆中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的动力学特性,采用35%和65%饱和度的硫酸铵分级沉淀、DE-52阴离子交换层析方法对明绿豆中的PAL进行了分离纯化,并对其基本性质做了初步研究。结果表明,PAL的纯化倍数为6.982 9,蛋白质得率为4.65%,酶得率为32.45%。PAL在硼砂-硼酸缓冲溶液中适宜的p H范围为7.6~9.0,最适p H有2个:8.0和8.6。PAL适宜的温度范围为35~45℃,最适反应温度为40℃。得到PAL的2个Km值,分别是:Km1为6.94×10-5mol/L,Km2为1.23×10-4mol/L。本研究结果可为进一步研究和开发明绿豆的PAL提供参考。     

采收成熟度与冷藏枇杷果实木质化关系研究

以七成、八成和九成熟的“解放钟”枇杷(Eriobotrya japonica Lindl. cv. Jiefangzhong)果实为试材,于4℃贮藏期间测定3 种不同成熟度果实的品质指标及木质化相关酶活性的变化,确定适宜于冷藏的枇杷果实采收成熟度,以减缓冷藏期间果实木质化败坏的发生,延长其贮藏期。结果表明：果实冷藏至35d,成熟度越高,果肉木质化越严重,但七成与八成熟果实木质素含量差异不明显(P ＞ 0.05);木质化程度相对较低;八成熟果实的总糖和可溶性固形物(TSS)含量明显高于七成熟和九成熟果实(P ＜ 0.05)。不同成熟度果实可滴定酸(TA)含量以及4- 香豆酸辅酶A 连接酶(4CL)、肉桂醇脱氢酶(CAD)和过氧化物酶(POD)活性差异不显著(P ＞ 0.05),九成熟果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性明显高于七成和八成熟(P ＜ 0.05),PAL 活性与木质素含量之间具有较高的正相关性(r=0.89)。不同采收成熟度与冷藏枇杷果实木质化密切相关,适于冷藏的枇杷果实以八成熟采收为宜。     

甜荞苯丙氨酸解氨酶基因PAL的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,首次从甜荞(Fagopyrum esculentum)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的cDNA ORF序列,命名为FePAL。该序列长2169bp,编码722个氨基酸,与其他植物PAL基因同源性较高,为80%～97%,其推导的氨基酸序列含有PAL酶活性中心特征序列GTITASGDLVPLSYIA和多个脱氨基、催化活性位点。系统发育树表明,甜荞PAL基因与苦荞PAL基因聚类关系最近。     

pH对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌生长及产酶的影响

为了提高重组大肠杆菌苯丙氨酸解氨酶的产量和活力，研究了发酵过程中pH对重组大肠杆菌的生长及产酶的影响。结果表明，发酵液pH对菌体生长及酶活有显著的影响，控制发酵液pH可以显著提高菌体量和酶活，当控制pH为7．5时，菌体量和酶活最高。在5L发酵罐分批发酵培养时，控制pH为7．5时的菌体量和酶活分别可以达到OD600=19，总酶活为123U／g，分别比不控制pH高出29％和33％。     

树莓汁中游离态和键合态香气物质的成分分析

采用Amberlite XAD-2树脂吸附洗脱分离的方法,对树莓汁中的游离态和键合态香气物质进行了分离,对提取得到的键合态香气物质进行酸法或酶法(β-D-葡萄糖苷酶)水解释放,并采用气相色谱进行检测分析,以明确树莓汁中游离态和键合态香气物质的种类和含量。结果表明,在树莓汁中共检出23种游离态香气物质,主要为脂肪醇类、酮类和酯类物质,苯甲醛是游离态组分中含量最高的物质;酶法水解后共检出20种键合态香气物质,主要为苯系物和脂肪醇类物质;酸法水解后共检出11种键合态香气成分,主要为萜烯类和脂肪醇类物质。     

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆与序列分析

基于酸性木聚糖酶在饲料及酿酒行业良好的应用前景,通过基因组步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全长基因xynA,然后采取重叠延伸PCR技术进行内含子的切除获得xynA的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。序列分析结果显示xynA基因全长720 bp,内含子63 bp,cDNA全长657 bp。推测该木聚糖酶编码信号肽28个氨基酸,成熟肽190个氨基酸;预测该蛋白为分子质量20.61 kD、等电点7.0的亲水性蛋白,且分子内不含二硫键。与其他真菌来源的GH11族耐酸性木聚糖酶进行序列比对,结果显示该酶的相应位置具有特征天冬氨酸残基Asp,且具有糖苷水解酶11族的保守区域特征以及典型的"右手半握"状结构,重组木聚糖酶基因xynA能够在大肠杆菌中成功表达,比酶活力达220.5 U/mg。     

酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因克隆及生物信息学分析

酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的独特生理特性,从该属细菌中分离到的多种酶类都具有耐酸热稳定性,是筛选耐酸耐热酶的重要菌种资源。超氧化物歧化酶(SOD)由于具有重要的生理功能而广泛用于食品、药品及化妆品等行业。为了深入探讨酸土脂环酸芽孢杆菌SOD的分子生物学特性,本研究利用同源克隆、交错式热不对称PCR技术和生物信息学方法进行Fe-SOD基因克隆、测序及序列分析。结果表明,Fe-SOD基因(GenBank序列号:JN614998)ORF全长为606bp,编码202个氨基酸,其推测氨基酸序列与来源于酸热脂环酸芽孢杆菌DSM446的Fe-SOD(ACV58017.1)序列相似性最高,为78%。整个蛋白序列含有Fe/MnSODs家族的5个模体,SOD活性中心含有金属离子结合配基His27、His82、Asp164和His168,具有Fe/MnSODs家族典型的蛋白结构特征。酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因的克隆和生物信息学分析为进一步构建原核表达载体、获得生产耐酸热Fe-SOD的基因工程菌株奠定基础。     

链霉菌DDE转座酶基因的克隆及生物信息学分析

从实验室保藏的菌株中筛选出一株产DDE转座酶的菌,经形态及生理生化、16S rDNA及建树分析比对,该菌株属链霉菌属灰褐类群,暂将其命名为Streptomyces labedae sp. X1。从Streptomyces labedae sp. X1基因组DNA扩增一401 bp的DDE转座酶基因,通过Blast和ISfinder数据库进行序列比对,结果显示其与ISAzo13家族转座酶的基因有88%的相似度。通过对其进行生物信息学分析,发现该基因可编码133个氨基酸,且该DDE转座酶的保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91上,理化性质结果显示编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构域,为非分泌蛋白;有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点;高级结构以α-螺旋为主;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示在27 ku处出现条带。该研究结果为研究链霉菌DDE转座酶基因的表达机制提供了重要信息,对以后鉴定DDE转座酶活性以及它的结构和功能奠定基础。     

海洋链霉菌KR结构域基因的克隆与分析

酮还原酶（Ketoreductase,KR）是聚酮合酶（Polyketide Synthase,PKS）重要的组分,可催化β-酮基的还原,是手性药物合成的重要手段,并在聚酮化合物合成中起着关键性作用。该研究从海洋链霉菌Streptomyces sp. X-66基因组DNA扩增出一条 1 331 bp的KR结构域基因,并进行生物信息学分析。Blast结果显示该序列包括了FAS KR和PKS KR两部分,核心功能区域集中于PKS KR基因部分序列;最大ORF区域拟编码333个氨基酸,理论等电点为4.80,分子式为C1500H2419N433O463S6,不稳定指数为24.85,为酸性稳定蛋白,并有较低亲水性,不含信号肽和跨膜结构,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为70 ku。通过氨基酸多序列比对,表明蛋白KR3属于B1型KR;以蛋白KR3氨基酸序列预测并检验其三级结构模型,利用分子对接和可视化分析预测蛋白KR3与配体结合的关键残基为204Thr、206Thr和207Leu,依据相关研究分析蛋白KR3引导底物进入活性中心的结合模式与B型KR较为符合,为进一步研究KR3的功能及新型手性药物和聚酮化合物的合成提供科学依据。     

酿酒酵母抗镉基因CAD1的克隆和分析

目的:克隆CAD1基因,对其结构和功能进行预测,为后期研究利用该基因用于重金属镉的解毒作用及其他有毒物质的抗性研究打下基础。方法:使用PCR技术对酿酒酵母BZL06的CAD1基因序列进行全长克隆,再对其进行染色体定位和亲缘关系分析,使用在线分析工具ExPASy、ProtParam等对其编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、结构域和蛋白互作进行预测分析。结果:该CAD1基因位于Ⅳ染色体1318046~1319275;全长1230 bp,可编码409个氨基酸,亲缘关系分析表明该基因与酿酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1基因(GenBank序列号为EIW11633.1)最为接近,同源性达到99%;编码的蛋白质为在细胞核中进行代谢调控的不稳定的亲水蛋白;存在明显的卷曲螺旋区域,不存在跨膜结构,二级结构预测中发现该蛋白主要存在α-螺旋和随机卷曲,β-转角与延伸链分散分布;预测存在bZIP和PAP1结构域;蛋白互作分析中相关系数0.7以上的蛋白有9个,其中相关系数为0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白。结论:分析结果得出克隆CAD1基因正确,其编码的蛋白结构不稳定,在细胞核中代谢,含有与重金属镉与其他有毒物的过表达中存在抗性的表达紧密相关的结构域bZIP和PAP1,在表达抗性时并与SKN7蛋白功能联系密切。     

蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和生物信息学分析

为研究蜡样芽孢杆菌LJ01(Bacillus cereus LJ01)中亚硝酸盐还原酶(NiR)的酶学性质,获得高表达量的基因工程菌,本文对B.cereus LJ01的NiR序列进行了生物信息学分析,并将NiR基因克隆到表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,随后探究了不同诱导条件对重组NiR表达量的影响。结果表明NiR编码蛋白的理论分子量约为60 kDa,理论pI为5.47,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,是不具有跨膜结构的亲水性蛋白。随着诱导温度的升高,重组NiR的表达量逐渐减少,诱导温度为16℃时重组NiR表达量最高。在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达量明显高于pET-32a(+)-nir-BL21,因此选用pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌。从B.cereus LJ01中克隆了NiR基因,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21,为该重组NiR的理化性质研究和食源芽孢杆菌中NiR的异源表达奠定了基础。     

海洋链霉菌差向异构结构域基因的克隆与分析

为研究差向异构结构域基因的序列特征以及其在非核糖多肽生物合成中的立体异构化特性,以海洋链霉菌 Streptomyces sp. X66基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆获得目的基因序列,经测序及生物信息学分析表明,该基因序列长 1 099 bp,Blast序列比对该基因与Streptomyces albidoflavus strain W68的E结构域基因序列相似度达99.45%,具有典型的差向异构结构域的功能区域,且包含差向异构结构域独有的保守基序HHxxxD,证明扩增的基因片段为差向异构结构域基因序列。理化分析显示：其拟编码366个氨基酸,理论等电点为5.69,原子组成为C1752H2738N510O523S3,不稳定指数为32.68,平均亲水系数为-0.15,编码产物为酸性亲水稳定蛋白,且不含信号肽和跨膜结构,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,SDS-PAGE显示其分子量约为55 ku,与预期相符。通过对差向异构结构域基因的研究,以期为进一步解析差向异构结构域功能及新型非核糖体多肽的研发提供科学依据。     

链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的克隆及生物信息学分析

本研究获得了海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因,并对其进行生物信息学分析。利用依据同源序列设计的兼并引物,对提取的链霉菌MY0504的基因组DNA进行PCR扩增,将得到的DNA片段连接到pMD18-T载体后转化感受态Trans10细胞,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析。最终克隆了1083bp的海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因。将获得的YG4基因输入Gen Bank网站,进行检索比对,结果显示与丝氨酸蛋白酶基因碱基序列同源性100%。对16s rDNA序列分析结果表明,该菌株与达格斯地链霉菌、氢化链霉菌、嫩白黄链霉菌、浅紫链霉菌的亲缘关系较近;通过对YG4基因编码蛋白的一级结构、二级结构、亚细胞定位和三级结构的预测和分析,结果表明:该基因编码360个氨基酸,其编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α螺旋和β折叠为主,无信号肽和跨膜结构域,有40个磷酸化位点;高级结构以无规则卷曲为主。本研究结果为研究海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的表达机制及目的蛋白表达水平的提高提供了重要信息。