木糖发酵酵母Pichia stipitis木糖还原酶基因XYL1在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1。将该基因连入酵母表达载体pYX2 12的强启动子磷酸丙糖异构酶 (TPI)启动子下 ,得到融合表达载体pYX XYL1。通过电转化方法将 pYX XYL1转入酿酒酵母SaccharonmycescerevisiaeW 30 3-1A中 ,酶活测定表明 ,在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1得到活性表达 ,2酿酒酵母转化子粗酶液中木糖还原酶活分别为 0 .89U/mg(蛋白 )和 0 .83U/mg(蛋白 ) ,为供体菌的 1 5倍多。与基因供体菌不同 ,木糖还原酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导 ,为组成型表达。树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1的成功表达为后续的利用木糖的酿酒酵母菌株的构建奠定了基础     

转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母的构建及产木糖醇能力研究

将人工合成的树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的木糖还原酶基因XYL1插入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pYES2中,然后将重组质粒pYES2-XYL1导入酿酒酵母INVSc1中,构建转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1,最后采用营养缺陷培养基筛选转木糖还原酶基因酿酒酵母并对其产木糖醇的能力进行检测。结果表明,成功获得2株转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02,当两菌株以50 g/L木糖及10 g/L半乳糖为碳源发酵5 d后,木糖醇产量分别高达（13.68±2.37）g/L、（12.09±1.45）g/L,显著高于非转基因酿酒酵母INVSc1的木糖醇产量（1.08±0.37）g/L（P＜0.05）,说明XYL1基因的导入显著提高了酿酒酵母INVSc1生产木糖醇的能力（P＜0.05）。为采用基因工程酿酒酵母制备食用木糖醇提供了理论及技术基础。     

木糖醇脱氢酶研究进展

综述了木糖醇脱氢酶研究现状,包括木糖醇脱氢酶的提取、结构、理化性质以及辅酶改造,同时对利用生物技术进行木糖醇脱氢酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。     

糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达

糖化酵母结构基因ＳＴＡ编码分泌到胞外的葡萄糖淀粉酶（α－１，４－葡聚糖－葡糖水解酶，ＥＣ３．２．１．３），俗称糖化酶。通过限制性内切酶Ｓａｕ３Ａ部分酶切糖化酵母染色体，以穿梭质粒ＹＥＰ１３作载体，建立糖化酵母的基因文库，转化ｓｔａ°ｉｎｈ°型酿酒酵母受体菌Ｃ＿２，筛选出三株ｓｔａ￣＋转化子，检测出５．３ｋｂ大小的外源基因片段，继而采用薄层层析、ＫＮＲ染料测酶活性等方法对外源基因产物进行了鉴定并测定了酶活最佳反应条件。     

利用基因敲除技术破坏酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的初步研究

文中采用醋酸锂转化法，将一段目的基因转入到酵母体内，破坏酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的表达。通过对目的基因的扩增和乙醇脱氢酶Ⅱ酶活检测验证基因敲除情况，并通过传代抗性试验验证突变株遗传稳定性良好。     

乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要。利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L1和L2扩增潮霉素B基因(两翼与酿酒酵母同源),按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adhI基因发生同源重组,得到一株ADHI酶活性降低的工程菌株。发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V),较原始菌株低了65%。说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因反义干扰及对乙醇发酵的影响

通过构建酿酒酵母沉默表达载体PURH-ADH2,使ADH2基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。采用Bam HI和Xmal I限制性内切酶对SADH2基因和PURH质粒进行双酶切,构建反义重组表达质粒PURH-SADH2,通过高效酵母转化法和电转法将重组质粒组件转化至酿酒酵母SY01细胞中,获得阳性克隆菌株JY01。酿酒酵母JY01突变菌株与出发菌株SY01和Y01发酵试验结果相比,JY01甘油脱氢酶酶活比出发菌株Y01与SY01分别下降了16.31%和13.5%;当酿酒酵母Y01、SY01和JY01菌株发酵36~60 h时,JY01菌株甘油含量相比Y01分别下降了16.34%、14.25%、14.89%;当酿酒酵母突变菌株发酵48 h时,Y01、SY01和JY01的乙醇浓度分别为6.243 g/100 m L、7.145 g/100 m L和7.288 g/100 m L,酿酒酵母JY01发酵液乙醇量比比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.33%。结果表明通过反义干扰ADH2基因5’UTR序列,能有效干扰酵母工程菌株ADH2转录与表达,削弱甘油积累途径,促进乙醇代谢途径。     

稳定高效表达木糖还原酶基因工业酿酒酵母的构建及木糖醇发酵的初步研究

将树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶基因XYL1连接到适用于酿酒酵母工业菌株的多拷贝整合载体pYMIKP中,构建得到表达质粒pYMIKP-XYL1,转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae6508。在G418平板上筛选转化子,得到含高拷贝木糖还原酶基因的酿酒酵母重组菌株XGH2,,该菌株的木糖还原酶比活力为0.8 U/mg(蛋白),比出发菌株提高了80倍以上,表明外源基因在工业菌株中实现了高效表达。摇瓶发酵结果显示,重组菌株XGH2木糖消耗为27.9 g/L,木糖消耗率为51%;木糖醇产量为30.2 g/L,木糖醇的转化率大于1.0 g/g木糖。     

L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325中的表达

本文研究了在m RNA转录水平上三种L-乳酸脱氢酶基因在乳酸乳球菌KLDS4.0325不同生长阶段的表达情况。以16s r RNA作为内参基因,应用实时荧光定量PCR技术测定不同生长阶段的菌体中L-乳酸脱氢酶基因(ldh、ldh X和ldh B)表达的动态变化规律。该菌株的生长曲线呈S型,培养2~6 h为菌体的生长对数期,随后进入稳定期。生长曲线的测定表明该菌株生长力极其旺盛;16s r RNA、ldh、ldh X和ldh B基因的扩增效率曲线显示,内参基因与目的基因的扩增效率一致且接近100%,这说明利用相对荧光定量法能够较好的反应目的基因的表达量;ldh、ldh X和ldh B基因在菌体生长的3个时间点(6 h、9 h和12 h)都有一定量的表达,随着菌体的不断生长,基因表达的变化均呈现显著性上升趋势,且上升幅度不断增加,在12 h时基因表达量达到最大值。其中ldh基因在的表达量在菌体生长的3个时间点存在显著性差异,而ldh X、ldh B基因的表达量存在极显著差异。     

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中稳定表达的策略

综述了宿主细胞的表达特点，外源基因的来源，表达载体和转化方法对α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中稳定表达的影响，并在此基础上提出了相应的策略。     

A short-chain dehydrogenase gene from Pichia stipitis having D-arabinitol dehydrogenase activity

An NAD⁺-dependent D-arabinitol dehydrogenase (polyol dehydrogenase) gene was isolated from Pichia stipitis CBS 6054 and cloned in Saccharomyces cerevisiae. The gene was isolated by screening of a λ-cDNA library with a zymogram technique. D -Arabinitol, xylitol, D -glucitol and galactitol are substrates for the recominant protein. With D -arabinitol as substrate the reaction product is D -ribulose. The molecular weight of the native tetramer enzyme is 110 000 Da and the monomer is 30 000 Da. The amino acid sequence is homologous to the short-chain dehydrogenase family. It is 85·5% identical to a D -arabinitol dehydrogenase from Candida albicans. The gene in P. stipitis was induced by D -arabinitol and P. stipitis was able to grow on D -arabinitol. The physiological role of D -rabinitol metabolism is discussed.     

高效表达木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母的构建及木酮糖发酵的初步研究

通过RT-PCR方法克隆得到Candida tropicalis木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因连入酵母表达载体pYES2的诱导型启动子GAL1下,构建表达质粒pYES2-xyl2;同时用从Pichia pastoris中克隆获取的甘油醛磷酸脱氢酶基因GAP换下GAL1基因,构建含组成型启动子GAP基因的表达质粒pYES2-GAP-xyl2;通过电转化法将其依次转入酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1,山梨醇培养基上筛选的转化子经木糖醇梯度驯化培养,筛选出1株耐木糖醇浓度为20%的酿酒酵母重组菌株ZCX4和1株在半乳糖诱导下耐木糖醇浓度为15%的重组菌株YDX2。酶活测定表明,重组菌株ZCX4比酶活0.621 U/mg(蛋白),是YDX2比酶活的2.29倍。摇瓶发酵结果显示,重组菌株ZCX4木糖醇消耗76.46 g/L,木糖醇消耗率为76.46%,是重组菌株YDX2木糖醇消耗率的1.63倍,说明木糖醇脱氢酶实现了高效表达。     

酿酒酵母中的蔗糖转换酶基因(SUC2)研究进展

蔗糖转换酶基因(SUC2)编码蔗糖转换酶(Invertase),通过降解酵母细胞外的蔗糖成果糖和葡萄糖来提供酵母生长所需的碳源,在以蔗糖为主要碳源的培养条件下,蔗糖转换酶对于酵母生长必不可少.因此研究蔗糖转换酶基因序列、转录、调控等对酵母蔗糖代谢具有重要意义.蔗糖转换酶基因的表达受葡萄糖浓度、氧气和其在染色体上的位置等因素的影响.本文就葡萄糖浓度对SUC2表达的影响以及葡萄糖浓度对其表达调控的机制进行了综述,并展望了该基因及蔗糖转换酶在今后的应用和研究趋势.     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母中的表达研究

将PCR合成的瑞氏木霉 (Trichodermareesei) β 内切葡聚糖酶I(EGI)cDNA基因片断分别插入酵母met1 0和 pgk1启动子和终止子序列之间 ,构建了在不同启动子控制下 ,具有不同拷贝数的eg1表达分泌质粒pRS41 5ME、pRS41 5PE和 pRS42 5PE。通过电转化使重组质粒转移至实验室酿酒酵母H1 5 8菌株中 ,分别得到了 3株酵母转化子H1 p、H2p和H1m。在 3株酵母转化子中 ,重组 β 内切葡聚糖酶I都能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达。在YPD培养基中 3株重组酵母生长速率大致相同 ,H1m ,H1 p与H2 p的内切葡聚糖酶活力分别为 70 .4,1 2 6.7和 1 2 5 .0U/mL。