超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展

细胞是生命体的基本单位和功能单位,对活细胞内部结构及其功能的研究是了解掌握生命本质的基础之一,因此活细胞的实时观测对生命科学的发展具有重要意义。传统的光学显微技术受衍射极限的限制,无法观测200 nm以下的生物结构细节。近20年来,随着超衍射极限光学理论、技术、器件和荧光探针等方面的快速发展,超分辨显微成像技术已成为应用于生命科学研究的重要手段。然而,大多数超分辨显微方法或测量耗时长,或易引起荧光蛋白漂白/细胞损伤,在活细胞研究中受到极大限制,已成为超分辨显微领域重点攻关的方向之一。为此,文中结合作者在快速超分辨显微技术研究的基础上,介绍了基于单分子成像的光激活定位显微技术和随机光学重构显微技术、基于荧光非线性可饱和光转换的受激发射显微技术以及基于结构光照明的超分辨显微技术,并探讨了在活细胞成像中的发展应用。最后,文中展望了超分辨显微成像技术在活细胞成像中的未来发展趋势。     

受激辐射损耗超分辨成像技术研究

受激辐射损耗显微成像(STED)是一种超分辨荧光显微成像技术,它能够突破传统光学衍射极限的限制,把远场光学分辨率提高到百纳米以内,被广泛应用于生物医学等领域,是目前光学显微成像领域研究的热点之一。采用了一种基于超连续谱皮秒脉冲白激光光源的STED显微系统,实现超分辨成像。并从精密合束、脉冲延迟和损耗光残留光强几个方面探讨系统优化,从而获得最佳的成像效果。对直径约25 nm荧光微球成像实验的数据表明:该系统成像分辨率可达约60 nm,分辨能力远远高于衍射极限。另外,系统成功实现了对核孔复合物、微管和微丝等一系列生物样品的超分辨成像,共聚焦成像中某些模糊不清的结构在STED成像中清晰可辨。     

利用受激发射损耗(STED)显微术突破远场衍射极限

远场光学显微镜受衍射极限分辩率的限制，而近场光学显微镜由于缺乏层析能力，则无法实现超分辨的三维成像，研究了既可突破远场光学显微术的衍射极限分辨率又可实现三维成像的成像技术——受激发射损耗（STED），综述了STED的分辨率与STED光的光强，延迟时间、光斑空间分布等主要参数的关系，以及该技术的最新进展和应用前景。     

超分辨荧光显微镜中的解卷积技术及应用（特邀）

超分辨荧光显微镜突破了光学衍射极限造成的空间分辨率限制,使得生物学家能够在生命体和细胞具有活性的状态下,对其功能与结构进行高精度动态记录,有望揭示更多重要的生命现象细节。然而,由于超分辨荧光显微技术的成像视场、深度、分辨率、速度等不易兼得,所以解卷积作为一种最有效且直接的求解逆问题的框架,被广泛应用于增强超分辨显微镜的时空分辨率。研究人员聚焦于通过相应算法设计实现高质量显微图像的重建,在一定程度上克服了超分辨荧光显微镜的硬件限制,可以更好地恢复生物信息。本文首先介绍了解卷积方法的基本原理及其发展历程,接着列举了不同解卷积技术在不同模态下的重建原理和效果以及这些技术在生物学上的应用,最后总结了基于深度学习的解卷积方法在超分辨荧光显微镜技术上的最新进展和未来的发展潜力,并对包括傅里叶环相关的定量评估图像重建质量的方法的最新进展进行了阐述。     

超分辨成像方法研究现状与进展

光电成像系统受到衍射极限和像元分辨率的制约,但研究者们从未停止过脚步来突破这一限制。本文介绍了近年来开展的各种超分辨成像方法和技术,包括应用于荧光显微成像的受激发射损耗技术、结构光照明技术、光激活定位技术与随机光学重构超分辨成像技术;可应用于显微系统、光存储与眼底成像的光瞳滤波技术与径向偏振光超分辨聚焦技术;应用于空间探测的合成孔径技术、光子筛成像技术、超振荡透镜技术、亚像元技术与焦平面编码技术。主要讨论了以上超分辨方法的原理、实现手段与目前发展水平。     

亚20nm荧光超分辨显微技术研究进展（特邀）

荧光超分辨显微技术自20世纪90年代诞生以来,经历了多代创新与发展,其空间分辨率已经远超衍射极限,横向分辨率能够达20 nm以下,可以实现分子尺度的生物成像与动态追踪。新一代超高分辨率显微技术的产生得益于传统超分辨技术的深度发展和结合创新。详细介绍横向分辨率在亚20 nm尺度的新一代荧光超分辨显微技术,并阐述其与传统超分辨原理的联系与区别。此外,针对分辨率的限制因素,就光学系统、扫描策略和样品制备等方面进行探讨,并展望高分辨率荧光显微技术在生物医学领域中的应用前景和发展方向。     

基于荧光随机涨落的超分辨显微成像

基于荧光随机涨落的超分辨显微成像技术具有成像速度快、空间分辨率高、系统成本低和光毒性小的成像优势,在对生物亚细胞结构及其动态运动过程的成像和监测中具有广阔的应用前景。近年来,基于荧光发射的间歇性,发展出多种图像重建算法实现荧光涨落超分辨成像,在无须对传统的荧光显微镜做任何硬件改造的情况下,显著提升了光学成像的空间分辨率,实现了突破光学衍射极限的超分辨成像。从重建算法、成像速度、分辨率提升和图像重建质量等方面,对比分析不同类型荧光涨落超分辨方法的差异和适用范围,为生命科学研究人员针对特定的生物学问题选择最佳的超分辨方法提供参考依据。     

受激发射损耗显微术及扩展技术

受激发射损耗(STED)显微术利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系,并通过限制受激辐射衰减的区域,减少荧光光斑大小,获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率,从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像。基于受激辐射损耗抑制的物理过程,论述了发生损耗抑制的工作机理和工作条件,介绍了STED系统的分辨率及系统组成,并详尽综述了双光束、双光子、双色、4Pi及松散三重态等STED最新拓展应用技术。最后说明了最新激光技术的进展为开发实用STED技术提供保证,展望了该技术未来发展的重点及应用前景。     

基于时间相关单光子计数的离线式g-STED超分辨显微术

提出了一种离线式基于时间门的荧光受激发射损耗(g-STED)显微方法。基于在强光照条件下荧光寿命缩短的理论模型,在常规STED架构基础上,使用时间相关单光子记数(TCSPC)算法获取图像的荧光寿命信息,离线设置合理的时间门阈值,丢弃短寿命信号数据,对荧光信号有效点扩展函数(PSF)进行压缩,达到超分辨显微的目的。与传统STED显微术相比,此方法所需光功率大幅度降低,减少了荧光漂白及光毒性;离线式处理则同时增加了时间门设置的灵活性。在实验中,使用45mW的连续STED光,最终获取了约80nm的图像空间分辨率。进一步对时间门的设置对获取图像信号的分辨率和信噪比的影响进行了讨论。     

压缩感知实现快速超分辨荧光显微成像

为了发展能够同时兼顾超分辨、快速成像和视场的荧光显微镜, 以促进其在活细胞或微观动态过程成像的应用, 将压缩感知应用到超分辨荧光显微镜中, 利用投影梯度稀疏重构算法对单帧荧光宽场图像重构, 并进行了理论分析、仿真和实验验证。结果表明, 该方法能够突破光学衍射极限, 成像分辨率达到180nm, 相比衍射极限提高1.8倍。此结果说明压缩感知能够实现单帧宽场超分辨荧光显微成像, 相比现有的方法在成像速度上有巨大的提升。     

饱和激发情况下油荧光非线性特征初步分析

利用激光诱导荧光( LIF)技术,从荧光强度和光谱偏移两个角度研究饱和激发状态下油荧光的非线性变化特征。利用能量变化的激光束诱导油样本荧光,获得荧光强度变化数据,通过非线性曲线拟合来标定荧光特征峰位430nm处的强度变化参数,获得该波长荧光强度的线性变化范围和非线性趋势,并利用探测波长处荧光强度构造出随诱导光强变化的三维油荧光光谱,实现基于激发光能量参量的油样本光谱区分。实验中,针对普通荧光光谱法无法区分的油样本,结合饱和激发状态下油荧光非线性变化和基于激发光能量参量的油样本光谱特征,实现了样本的有效区分。     

荧光共焦显微术与多光子显微术的差别

共焦显微术和多光子显微术因其可以对厚的生物样品实现光学断层成像，因而在生物医学等领域具有广泛的应用前景，本文详细综述了共焦显微术和多光子显微术在成像原理及特性等方面的差别，在此基础上，讨论了每种显微术各自的优点、局限性及应用前景。     

双路频分复用荧光共焦显微探测技术研究

报道了结合频分复用技术来提高荧光共焦生物显微探测系统探测能力的实现原理和方法。通过对双路激发光信号的载频调制,将激发光聚焦到生物样品上产生荧光信号,再通过傅里叶变换、滤波和解调制过程,最后将两路荧光信号强度随时间变化曲线进行还原。实验搭建了紫外波段激励光源的双频复用荧光共焦显微成像系统,并成功探测到了鼠神经海马细胞样品发出的双点荧光信号。频分复用共焦显微成像系统能够多通道、实时、快速地探测生物细胞荧光信号,并具有较高的时间和空间分辨率。     

四路频分复用荧光共焦显微探测系统实验研究

报道了采用全息聚合物分散液晶(H-PDLC)布拉格光栅阵列斩波调制的四通道频分复用荧光共焦显微探测系统的实验研究。通过高衍射率H-PDLC布拉格光栅将单束激光分成四束激发光并进行不同频率的载频调制,将激发光聚焦到生物样品上产生荧光信号并采集后,再通过傅里叶变换、滤波和解调,最后将采集到的信号还原成四路荧光信号强度随时间变化的曲线。实验搭建了激发光中心波长为405 nm的四路频分复用荧光探测系统,并成功探测到鼠神经海马细胞样品中激发的四点荧光信号的图像以及强度变化信息。     

基于时间分辨荧光各向异性成像的罗丹明B溶液粘度特性研究

基于时间分辨荧光各向异性成像技术,利用激光扫 描共聚焦显微镜耦合时间相关单光子计数系统,对不同浓度甘油及不同浓度蔗糖的罗丹明B 溶液粘度的荧光各向异性进行了测量。实验表明,随着溶液浓度增大,荧光偏振值和粘度都 相应增大,而荧光寿命与溶液微环境的粘度成反比。据此,基于荧光分子各向异性的产生原 理,给出了荧光团在转动过程中旋转弛豫时间与旋转相关时间的定量关系。它表明时间分 辨荧光各向异性检测可用于微环境粘度的检测和源自细胞内粘度变化导致的机体某些疾病或 机能失调的诊断。     

激光共聚焦显微镜观察光敏剂ALA和HMME在肿瘤细胞的胞内分布

目的：研究不同光敏剂在肿瘤细胞的胞内分布,观察光敏剂的亚细胞光化学作用位点。方法：使用激光共聚焦显微镜观察光敏剂5-ALA和HMME在结肠癌SW480细胞及红白血病K562细胞的胞内分布。结果：5-ALA及HMME在进入肿瘤细胞早期主要分布于胞膜。而在后期主要以颗粒状荧光分布于胞质,5-ALA分布相对弥散,HMME分布相对集中,核内分布极少。结论：光敏剂5-ALA和HMME主要分布于肿瘤细胞的胞质,这表明它们的光化学作用位点首先在胞质内细胞器,而不是细胞核。     

荧光显微镜的成像原理及其在生物医学中的应用

随着科学技术的快速发展,荧光显微镜成像在生物医学领域的应用越来越广泛.常见的荧光显微镜大致可分为普通荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、超分辨率显微镜和多光子激光扫描显微镜.本文详述了几种常见显微镜的原理、特性及其在生物医学中的应用.     

Breaking the optical difraction barrier with nanophotonics - Ultrahigh-resolution bioimaging and biosensing in the subwavelength nanometric range with nanobiophotonic technologies

The main goal of this study is to develop novel fiber-optic-based nanobiophotonics techniques for noninvasive imaging and biosensing optical properties of cellular and tissue samples beyond the diffraction barrier in the subwavelength nanoscale range. The work covers fundamental principles, recent developments, and trends in advanced nanobiophotonics techniques exploited for either minimally invasive diagnostics and imaging in biomedicine at cellular/intracellular level or development of nanosensors and nanostructured materials. Somerecently developed advanced ultrahigh-resolution nanotechnologies such as confocal nanoscopy and fiber-optic-based nanosensors, will also be discussed. These technologies allow one to break the theoretical optical diffraction barrier and to work in the subwavelength nanoscale range     

Enhanced Fluorescence Microscopic Imaging by Plasmonic Nanostructures: From a 1D Grating to a 2D Nanohole Array

A two‐dimensional (2D) plasmonic coupling nanostructure for enhanced fluorescence observation using a microscope is presented. The substrate contained periodically assembled nanohole arrays with a pitch of 400 nm and a depth of 25 nm. In comparison with one‐dimensional (1D) gratings, this new substrate presented an excellent surface plasmon coupling ability to illuminate light from all directions. Under an optical microscope, an enhancement in the fluorescence intensity of up to 100 times compared with a plain glass slide was observed. The ability to markedly increase the fluorescence intensity means this technique has great potential for application in biodiagnostics, imaging, sensing, and photovoltaic cells.