冷鲜鸡肉中莓实假单胞菌NMC25的全基因组测序及分析

通过PacBio RS II测序平台,对在腐败冷鲜鸡肉中分离到的1 株莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi NMC25）进行基因组完成图测序,并对测序数据进行组装、基因预测和功能注释。同时与已公布全基因组序列的铜绿假单胞菌PAO1（P. aeruginosa PAO1）、恶臭假单胞菌KT2440（P. putida KT2440）和荧光假单胞菌F113（P. fluorescens F113）及另外2 株莓实假单胞菌分离株（P121和NRRLB-727）进行初步比较基因组分析。结果显示NMC25菌株基因组大小为5.152?13?Mb,GC含量为59.21%,包含1?个染色体和3?个质粒。通过对COG、GO、KEGG和CAZy数据库的比对分析发现基因组中包含大量致腐相关基因。比较基因组结果表明莓实假单胞菌NMC25与其他3 种假单胞菌的共线性序列比例较小,而同种之间与P. fragi P121的共线性比例也不足70%,说明不同环境来源的莓实假单胞菌分离株基因组存在较大差异。本研究结果从基因水平上证明了莓实假单胞菌NMC25确实有较强的致腐潜力,有助于深入了解莓实假单胞菌的代谢特征,为今后阐明其对冷鲜鸡肉的致腐机制提供理论支撑。     

芳樟醇对三文鱼源莓实假单胞菌的抑菌机理

本研究应用高通量测序技术分析不同贮藏期三文鱼的菌相变化,并分离、纯化、鉴定出1 株4 ℃贮藏环境下三文鱼的优势腐败菌——莓实假单胞菌MS 02（Pseudomonas fragi MS 02）。再以分离出的莓实假单胞菌MS 02为靶标菌,深入探究芳樟醇对其抑菌性能及其抑菌机理。结果表明：4 ℃贮藏三文鱼的菌相呈现动态变化的趋势,其中发光杆菌属、假单胞菌属、青枯菌属和不动杆菌属细菌在三文鱼贮藏中占主要地位。随着贮藏时间的延长,假单胞菌属的相对丰度逐渐增大,而莓实假单胞菌是三文鱼在贮藏期间增长速率最快的菌种。以分离鉴定出的莓实假单胞菌MS 02为研究对象,发现芳樟醇对其具有良好的抑菌效果,扫描电子显微镜观察结果表明芳樟醇能使细菌细胞膜产生凹陷褶皱,而电导率、OD260 nm、二乙酸荧光素荧光强度和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）、钠钾ATP酶活力测定结果证明芳樟醇能破坏莓实假单胞菌的细胞膜和细胞壁的通透性和完整性,进而影响细菌细胞正常能量代谢,最终导致菌体死亡。     

微酸性次氯酸水结合乳化剂酪蛋白酸钠对冷鲜肉主要腐败菌的杀菌作用

目的：研究微酸性次氯酸水（slightly acidic hypochlorous water,SAHW）对冷鲜肉主要腐败菌莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）及荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的杀菌作用,提高其对冷鲜肉表面腐败菌的杀菌效果。方法：在研究50 mg/L的SAHW结合0.02%（质量分数,下同）酪蛋白酸钠稳定性（贮存过程中有效氯质量浓度及pH值变化）的基础上,测定SAHW结合0.02%酪蛋白酸钠处理后冷鲜肉体外及体内假单胞菌菌落总数。结果：避光封口贮存方式下的SAHW与酪蛋白酸钠混合液的稳定性最佳。在体外条件下,SAHW对P. fragi和P. fluorescens杀菌作用在不同质量浓度及作用时间下相较于混合液均更强,在SAHW质量浓度为50 mg/L时,SAHW及混合液对P. fragi的致死对数值分别为6.16(lg(CFU/mL))和2.26(lg(CFU/mL)),致死率分别为85.20%和31.26%。体内实验结果显示,50 mg/L SAHW与0.02%酪蛋白酸钠混合液对P. fragi及P. fluorescen...     

草莓酸对莓实假单胞菌群体感应的抑制作用

目的:利用报告菌株紫色杆菌探究草莓酸的群体感应抑制性及其对莓实假单胞菌的群体感应作用。方法:利用细菌凋亡率、气相色谱-质谱分析、生物膜的抑制效果、胞外聚合物生成量以及观察细菌的群集和泳动等参数,来研究草莓酸对莓实假单胞菌群体感应的抑制效果。结果:草莓酸的最小抑菌浓度(MIC)为0.5 mg/mL,亚抑菌浓度下草莓酸虽然降低了菌株CV026产生紫色素的能力,但对细胞凋亡没有任何影响。通过气相色谱-质谱定量检测发现莓实假单胞菌所产的群体感应信号分子是C8-HSL和C10-HSL,草莓酸对信号分子的分泌产生抑制效果。在亚抑菌浓度下草莓酸对莓实假单胞菌的生物被膜形成量为21.06%,细菌的群集和泳动的抑制率分别降低34.06%和75.02%,且呈现质量浓度依赖性。结论:草莓酸具有较好的群体感应抑制性,可以作为水产保鲜中的群体感应抑制剂。     

基于高通量测序和可培养方法的勐海发酵普洱茶细菌多样性分析

以勐海地区百中堂茶厂发酵普洱茶为研究对象,采用高通量测序技术,并结合传统可培养方法,对普洱茶从晒青毛茶原料到发酵完成过程中9个时间节点的细菌多样性进行了研究。结果表明,普洱茶发酵过程中细菌多样性丰富。高通量测序数据分析到61个属,212个OTU,发酵前期以欧文氏菌属(Erwinia sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)为主,而发酵中、后期芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)及小短杆菌属(Brachybacterium sp.)为优势菌群稳定存在。通过可培养方法,从发酵过程中分离到细菌18个属,30个种,优势菌属包括微杆菌属(Microbacterium sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、小短杆菌属(Brachybacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)和芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等。     

冷鲜牛肉贮藏中菌群结构及优势菌致腐性的分析

为探究牛肉在0?℃冷藏下微生物菌群变化和优势腐败菌,采用培养依赖的16S rRNA结合高通量测序技术分析牛肉样品的微生物多样性变化。通过定期测定接种牛肉汁的生长、感官、蛋白酶活性、pH值和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）值,分析分离株的致腐特征。结果表明,牛肉冷藏中感官品质保持良好,15?d出现异味,18?d有腐臭味。而样品中菌落总数第3天快速上升,15?d菌落总数为8.73（lg（CFU/g））,之后呈现稳定,假单胞菌（Pseudomonas spp.）、热死环丝菌（Brochothrix thermosphacta）、肠杆菌（Enterobacter）和乳酸菌4 种分离培养基中细菌与菌落总数增长趋势相似,其中假单胞菌增长最快,肠杆菌数和乳酸菌数生长最慢。两种菌群鉴定结果显示,冷鲜牛肉初始微生物构成复杂,包括热死环丝菌、不动杆菌属（Acinetobacter spp.）、气单胞菌属（Aeromonas spp.）和假单胞菌等多种菌属构成,而腐败末期菌群构成趋于单一,假单胞菌和热死环丝菌为优势腐败菌,特别是莓实假单胞菌（P. fragi）。将腐败分离株10?株假单胞菌、4?株热死环丝菌和1?株蜂房哈夫尼菌（Hafnia alve）接种于冷藏的牛肉汁,发现假单胞菌和蜂房哈夫尼菌的接种组感官评分、pH值和TVB-N值高于热死环丝菌,且假单胞菌有较强的蛋白酶活性。研究表明,结合感官和微生物评价冷鲜牛肉贮藏期为15?d,且菌群多样性下降,假单胞菌和热死环丝菌是优势腐败菌,其中假单胞菌致腐性较强。     

西沙野生诺尼果内生菌的分离与鉴定

采用传统微生物学分离培养方法对我国海南西沙野生诺尼果内生菌进行分离与鉴定研究。计数结果显示,成熟野生诺尼果内生菌菌落总数达1.0×105CFU/g,其中真菌总数为8.0×103CFU/g。进一步在25²8℃下分离得到22株细菌、14株酵母菌和9株霉菌,分别采用16S rDNA、26S rDNA D1/D2区和ITS rDNA序列进行扩增和系统发育分析。结果表明,(1)22株内生细菌分属于α变形菌纲(α-Proteobacteria)、β变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ变形菌纲(γ-Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)5个类群,包括亚西亚菌属(Asaia sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、短小杆菌属(Curtobacterium sp.)、藤黄色杆菌属(Luteibacter sp.)8个属的10个已知种;(2)14株酵母分属于担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota),包括隐球酵母菌属(Cryptococcus sp.)、Pseudozyma sp.、Sympodiomycopsis sp.和假囊酵母属(Eremothecium sp.)4个属的5个种;(3)9株霉菌均属于子囊菌门(Ascomycota),包括枝孢属(Cladosporium sp.)、轮层炭菌属(Daldinia sp.)、赤霉菌属(Gibberella sp.)、Nemania sp.和青霉属(Penicillium sp.)5个属的5个种。     

西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

主要研究西沙群岛野生诺尼叶片中可培养内生菌的多样性。利用常规平板分离方法进行菌株分离。通过测定真菌核糖体基因翻译间隔序列(ITS序列)和细菌16S r DNA基因序列,结合系统发育研究对所分离菌株进行鉴定分析。共分离到32株内生菌,分为19种。其中2种霉菌,共2株,分别属于炭层菌属(Nemania sp.)和毛壳菌属(Chaetomium sp.);细菌17种,共30株,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)等7个已知属,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为绝对优势属,共20株,11种。     

芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性及机制

食品在生产、运输和贮藏过程中易受致病菌污染而引起食源性疾病。芳樟醇具有抗菌作用,但其作用机制尚不明确。研究芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性及作用机制,可为其作为天然食品防腐剂的开发提供理论依据。通过测定最小抑菌浓度、绘制细菌生长曲线评价芳樟醇的抑菌活性;通过扫描电子显微镜观察、结晶紫染色实验、二乙酸荧光素染色实验以及测定电导率、核酸泄漏、呼吸代谢活力和呼吸链脱氢酶活性的变化探究芳樟醇的抑菌机制。结果表明：芳樟醇对莓实假单胞菌具有较强的抑制作用,最小抑菌浓度为1.5 mL/L;芳樟醇能破坏莓实假单胞菌细胞的结构形态和细胞膜的完整性,增加细胞膜的通透性,导致胞内物质泄漏、膜外电导率升高;能抑制呼吸代谢活力和呼吸链脱氢酶活性,破坏呼吸链,导致胞内代谢紊乱。研究认为,芳樟醇可通过破坏莓实假单胞菌的细胞结构和抑制其呼吸代谢而发挥抑菌作用,有望作为天然防腐剂应用于食品的防腐保鲜。     

一例茶饮料污染源的分析

某企业生产的一批茶饮料中发现某些产品变质,3份样品出现pH值下降,或产气胀罐现象,或有肉眼可观察到浑浊、变色等感官指标的变化。检测发现引起腐败变质的主要是细菌,其数量≥104 CFU/mL,4株主要污染菌菌株经16S rDNA序列比对,鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)和短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。样品中还有数量很低(101～102 CFU/mL左右)的霉菌检出,经形态观察初步鉴定为交链孢霉(Alternaria spp.)、枝孢霉(Cladosporium spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)和青霉(Penicillium spp.)。该案例中霉菌虽然不是主要的腐败变质菌,但是其菌相组成与空气中主要的霉菌菌相一致,显示该污染的源头可能是空气,细菌的组成也能支持这个推论。实践中,通过更换无菌空气过滤器,确实解决了污染问题,证实了该推论。     

细菌对肉类表面吸附的研究

在屠宰过程中肉类微生物的污染是不可避免的。对吸附在肉类表面的Pseudomonasfragi和Brochothrixthermosphacta互生菌群进行了研究。这种细菌能很容易很迅速地吸附在牛的瘦肉组织和脂肪组织上,Pfragi的吸附量大于Bthermosphacta的吸附量。在pH值5．8～7．2之间吸附过程不受影响,在吸附过程的1～10min内,Pfragi具有时间依赖性,而Bthermosphacta则不具此特性。了解微生物在肉类表面吸附性,可设法减少微生物对肉类的污染。     

菱角壳黄酮提取物抑菌活性评价及对冷鲜鸭肉中假单胞菌生长特性的影响

为探究菱角壳黄酮提取物的抑菌能力及其对冷鲜鸭肉中假单胞菌生长特性的影响,采用抑菌圈法、MIC值测定和液体中生长曲线来评价其对食品中常见微生物生长的抑制作用,建立假单胞菌经浓度为2.5 mg/mL的黄酮纯化物处理后的鸭肉基质中的一级生长预测模型。结果表明:菱角壳黄酮提取物对假单胞菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,其中黄酮纯化物对假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果更好,抑菌圈直径分别为(47.01±0.43)、(45.06±0.35) mm;菱角壳黄酮提取物对热杀索丝菌有一定的抑制效果,对大肠杆菌、乳酸菌和酵母菌无抑菌效果。菱角壳黄酮粗提物和纯化物对假单胞菌的MIC值均为3.125 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为12.000和3.125 mg/mL。采用对供试菌抑菌效果最好的菱角壳黄酮纯化物浓度(2.5 mg/mL)处理鸭肉,在不同温度下储藏,发现与10、15和20 ℃相比,0和5 ℃可将冷鲜鸭肉的货架期延长至8 d以上,并且通过建立假单胞菌在经浓度为2.5 mg/mL的菱角壳黄酮纯化物处理后的鸭肉基质中的一级模型可知,在0~15 ℃储藏时,菱角壳黄酮提取物作为保鲜剂的抑菌效果较好,能够有效延长食品保质期,但随温度升高,其抑菌能力逐渐减弱,这为菱角壳开发为天然抑菌剂提供了理论基础。     

泡椒凤爪加工过程中细菌群落组成及变化分析

该研究采用传统培养法结合高通量测序法分析了泡椒凤爪加工过程每一个步骤中细菌数量及群落组成的变化,以确定其加工过程中的主要污染及微生物组成情况。结果表明：Y5（切分）是重要污染环节,菌落总数增加至2.20×104 CFU/g。Y9（真空包装）菌落总数（30 CFU/g）较Y7、Y8增加,且细菌多样性最高（Shannon=7.82）,可能是真空包装过程给产品带来了一定的污染。Acinetobacter（不动杆菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）和Psychrobacter（嗜冷杆菌属）等是泡椒凤爪加工过程中的优势菌属,平均相对丰度分别为21.50%,9.29%,5.99%。而Y10（辐照杀菌后成品）中相对丰度较高的菌属包括具有一定的产蛋白酶和脂肪酶能力的Acinetobacter（不动杆菌属）（3.23%）、Serratia（沙雷氏菌属）（4.86%）、Staphylococcus（葡萄球菌属）（6.26%）和Bacillus（芽孢杆菌属）（4.59%）,其中部分菌属还包含致病菌株,在储藏及销售过程可能会给产品带来质量及安全问题。研究结果加深了对泡椒凤爪加工过程中微生物污染及群落组成的认识,可为后续泡椒凤爪微生物污染防控及产品品质和安全性提升提供一定的理论依据。     

Market surveillance for contamination with thermotolerant campylobacters on various categories of chicken meat in Switzerland

From April 2009 to April 2010, 1,132 samples of different types of chicken meat were tested qualitatively and quantitatively for thermotolerant campylobacters. Samples were recovered at retail in shops from the entire territory of Switzerland and comprised imported meat and meat from domestic production. The meat categories covered by the study were refrigerated and frozen meat, meat with and without skin, and meat preparations. Overall, 38.4% of the samples were positive, and in 27.8%, Campylobacter bacteria could be quantified. Counts ranged from ≥10 to <10(4) CFU/g with a maximum value of 8 × 10(3) CFU/g in a sample of refrigerated chicken meat with skin. The contamination frequencies were 45.2% in meat with skin, 40.8% in meat without skin, and 27.4% in meat preparations. Refrigerated meat was contaminated with Campylobacter bacteria more often than frozen meat (53.9 versus 20.0%). The study also showed considerable differences between the contamination rates found for samples from different large retail chains. In 2010, a further study with 120 samples of refrigerated and sliced chicken meat and fresh chicken liver was carried out in order to test a possible seasonal variation of the occurrence of Campylobacter bacteria. The contamination frequency of sliced meat increased from 10.0% in the period from February to March to 36.7% during July to August. In both sampling periods, the counts remained in the range of ≥10 to <100 CFU/g with a maximum value of 30 CFU/g. For chicken liver, a 10.0% contamination rate was observed in the period from December to January, which rose to 100% in the period from August to October. Contrary to the results for sliced meat, not only did the frequency of contamination increase but so did the Campylobacter counts, with the highest recorded value being 2.2 × 10(4) CFU/g.     

Reduction of the spoilage-related microflora in absorbent pads by silver nanotechnology during modified atmosphere packaging of beef meat

Silver-based antibacterial hybrid materials have been developed by in situ reduction of silver nitrate (1%) adsorbed on cellulose fibers by thermal and UV treatments. Microscopy revealed that the silver nanoparticles were dispersed and regular in shape. Migrated silver ions achieved 60 ppm in beef meat exudates. The ability of the silver-loaded absorbent pads to lower microbial contamination of exuded fluids was studied during storage of beef meat in modified atmosphere packaging. Cellulose-silver hybrid materials reduced the levels of the major microbial groups (total aerobic bacteria, lactic acid bacteria, Pseudomonas spp., and Enterobacteriaceae) present in the absorbent pads by an average of 1 log CFU/g during the entire storage period. The levels of total aerobic bacteria and Pseudomonas spp. were significantly reduced in the presence of silver ions, whereas lactic acid bacteria were less sensitive and not significantly affected. Enterobacteriaceae levels remained under the detection limit when silver was present. Neither the color of the meat nor the microbial loads were markedly affected by the presence of the silver-based antimicrobial hybrid materials.     

不同时期鲳鱼冷藏期间优势腐败菌的多样性变化

目的：比较分析不同时期冷藏鲳鱼（Pampus argenteus）贮藏期间的感官品质、pH值、微生物指标与主要微生物菌群的变化规律。方法：冷藏（4±1） ℃条件下,以感官评定、pH值与菌落总数为品质评价指标,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增结合生理生化鉴定法分别对冬、春两个时期的鲳鱼进行优势腐败菌的变化规律研究。将经细菌培养与分离纯化得到单菌落按其形态特征进行分类,再通过生理生化鉴定与革兰氏染色,初步得到菌落种类,对单菌落进行DNA提取与PCR扩增并测序。结果：冬季样品获得12 种菌株,春季样品获得9 种菌株。贮藏末期时,冬季样品中优势腐败菌的种类与比例分别为嗜冷杆菌（Psychrobacter spp.）21.51%、草莓假单胞菌（Pseudomonas fragi）16.13%、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）52.68%与热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）9.68%;春季样品为草莓假单胞菌（Pseudomonas fragi）8.62%、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）64.66%与腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）26.72%。结论：冬、春时期中冷藏鲳鱼贮藏期间优势腐败菌的种类基本一致,以革兰氏阴性菌为主,但在细菌种类与比例上存在差异,冬季样品的微生物种类较春季丰富。贮藏期间,随着荧光假单胞菌所占比例的增加,使腐败希瓦氏菌的生长受到明显抑制。     

冷藏牙鲆中主要腐败菌卵黄抗体的抑菌性能

根据菌落形态、生理生化特征,利用细菌鉴定系统,对4℃冷藏养殖牙鲆货架期终点时的主要腐败菌进行定性和定量研究。最终确定4℃冷藏货架期终点时养殖牙鲆的优势腐败菌为腐败希瓦氏菌,占细菌总数的比例约为58.4%。水产品中常见的腐败菌假单胞菌属细菌主要包括荧光假单胞菌、腐臭假单胞菌和边缘假单胞菌,它们在假单胞菌属中所占的比列依次是63.2%、29.2%、7.6%。以3 种主要的腐败菌腐败希瓦氏菌、荧光假单胞菌和腐臭假单胞菌作为混合抗原,以两种不同方式免疫产蛋母鸡,制备两种卵黄抗体,并对其液体和固体培养条件下的抑菌效果进行研究。结果表明：液体培养8h,质量浓度为100mg/mL 的两种混合抗体对抗原菌的抑制率能达到61%～78%; 固体培养24h 后, 同样质量浓度的两种混合抗体对抗原菌的抑制率能达到27%～40%。这表明卵黄抗体有望作为一种新型的天然抑菌剂应用于水产食品的抑菌防腐。