基于微型DNA条形码的多种动物源性成分的鉴定

通过分析51?种动物的DNA条形码序列,新设计一对微型DNA条形码的通用引物,建立一种联合微型DNA条形码和克隆测序法对动物源性多组分样品进行准确、高效鉴定的方法。用微型DNA条形码分别鉴定11?种常见食用肉类,判断其对物种鉴定的准确性,并比较其与标准DNA条形码对物种的鉴定效果,然后将11?种常见商品肉类等比例混合,探究克隆测序法对混合肉样品的鉴定效果。结果表明：引物有较好的通用性,能对具有不同的引物同源性水平的11?个物种进行有效扩增并获单一条带。微型条形码能准确鉴定11?个肉类物种,与常规DNA条形码鉴定效果一致。经克隆测序法,把混合样品的9?个物种一并检出,总体上达到了较高的检出效率,同时深入讨论了未能检出全部物种的原因。微型条形码良好的物种鉴定能力的研究结果为联合微型DNA条形码与二代测序技术进行混合样品中物种的高效鉴定提供参考依据。     

基于扩增子测序技术非定向筛查食品中的植物成分

为进一步解决食品中基于扩增子测序的植物成分掺假非定向筛查问题,实现对植物源性成分高通量的检测和评估,该研究基于扩增子测序技术,利用植物通用引物RbcL,开发了常见植物成分非定向筛查方法。通过PCR技术,以红小豆、大豆、绿豆、红薯、马铃薯、木薯、薏米、小麦、玉米、小米、水稻、杏、腰果、榛子、芝麻、巴旦木、核桃、桃、香蕉、梨、小番茄、南瓜、胡萝卜、苹果、花生、开心果、芸豆27种植物物种提取的DNA为模板对该方法进行特异性、通用性、灵敏度验证。结果表明,通过DNAMAN软件与美国国立生物技术信息中心数据库比对测序,可有效区分不同植物物种。此外,利用二代测序分析技术对4个混合植物源性成分样本进行高通量、非定向筛查,测序结果与产品标识一致。该方法的建立对于植物源性成分的掺杂掺假鉴定和监管、消费者权益的保护具有重要意义。     

DNA条形码COI序列在常见肉类鉴别中的应用研究

为了对常见的4种肉类及相关肉制品进行掺假鉴定,判别与产品标签是否相符,本研究以COI基因为靶基因,建立了4种动物源性食品DNA条形码鉴别技术。分别提取牛、羊、猪、鸭四大物种的基因组DNA为模板,以其COI基因的保守序列区设计6对通用引物,结合文献报道及数据库提供的7对通用引物进行PCR扩增,并将测序结果提交Gen Bank数据库Blast比对,评价不同DNA条形码的检测鉴别能力。筛选出COI-A为最优序列,在4个物种中扩增效率100%。对抽检的20个批次的肉加工品样品进行检测,鉴定结果约有90%的样品与产品标签标示的成分相符。其中1个批次的牛丸制品因肉类成分含量低未扩增成功,1个批次的牛丸制品检出鸭源成分,判定掺假。DNA条形码技术快速有效,本研究筛选的COI-A序列可直接用于牛、羊、猪、鸭及其肉制品的鉴定,并为其它常见动物源性食品的种类鉴定提供一定参考依据。     

基于PCR技术的肉类成分溯源鉴定方法研究进展

近几年屡屡曝光的食品安全事故引起了社会的广泛关注,食品安全已经成为社会共同关注的问题,肉类掺假造假现象更是层出不穷,其中用低价鸡肉、鸭肉、猪肉等掺入、冒充牛羊肉成为主要的掺假方式。国内外进行肉类掺假鉴定主要以核酸作为靶标,核酸鉴定也是物种鉴别最常用、最核心的方法,以DNA检测为基础建立起来的DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR、荧光探针等技术也得到空前发展和广泛应用。我国针对动物源性成分检测也制定了相关国家标准和行业标准,但大多现行标准中基于DNA检测建立的PCR技术只能检测单一物种,滞后于技术的发展。目前,基于PCR发展起来的衍生技术凭借其高灵敏度、强特异性和高通量等优势在动物源性成分检测工作中显示出巨大潜力,也是肉类成分鉴定未来的重要方向。本文综述了PCR技术在肉类检测中的研究概况和现行标准的技术概况,以期为肉类成分鉴定研究提供信息。     

肉制品中动物源性成分DNA检测方法的研究进展

肉制品主要成分标识的真实性是全球重要的食品安全问题之一,特别是肉制品中动物源性成分的掺假和标识问题已引发全球关注。如何对肉制品中动物源性成分进行鉴定和标识已成为产品真实性鉴定的热点。基于DNA分子稳定性强的优点,DNA检测技术被广泛用于食品安全检测和监测诸多领域,体现出了灵敏度高、特异性强等优势。本文重点从动物源性检测的靶序列DNA选择和DNA分析技术研究2个方面,阐述了肉制品中动物源性成分定性、定量检测技术的研究和应用,并讨论动物源性成分定量分析的可能性,为我国实施动物源性成分量化监管提供思路。     

食品中动物源性成分的多重PCR快速检测

目的利用多重PCR技术对市售的多种食品进行检测,确定动物源性成分的种类,进行掺假及真伪鉴别。方法对鸡、猪、牛、兔、绵羊、山羊、马、鹿8种动物源性产品进行DNA提取,根据不同动物线粒体DNA设计特异性引物,根据脊椎动物细胞色素b基因mt DNA序列设计通用引物作为内源参照,对8种动物源性产品的DNA进行多重PCR扩增,同时对多种成分进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳表明,此方法能同时扩增出8种动物的特异性条带,检测灵敏度达到0.01%。结论所建立的鉴定多种动物源性成分的新方法,操作简便、快速准确,可为各检验机构对食品进行检测提供方法指导。     

肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR检测

通过实时荧光PCR技术检测肉制品中鸵鸟源性成分。根据鸵鸟线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COX1)序列,用Primer Express和DNAMAN软件设计特异性的引物和Taq Man探针,并用阳性样本进行验证。结果表明,引物和探针对鸵鸟源性成分的特异性良好,与常见物种DNA无非目标扩增,该方法的检测灵敏度达0.27 pg/反应,适用于鸵鸟源性成分的鉴定,从而建立了肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR鉴定方法 。     

DNA条形码技术在深加工动物制品源性成分鉴定中的应用研究进展

DNA条形码被认为是一种强大、非定向、准确特异、低成本且适用广泛的方法,是分子生物学领域研究物种鉴定的热点技术。其基于DNA分子水平和通用引物扩增的鉴定方式规避了传统鉴别方法的不足,又超脱于许多分子检测方法只能定向检测的局限,现已被广泛应用于生态环境、医疗卫生、食品安全等各个领域。本文介绍了DNA条形码的基本原理、发展进程和研究现状,总结了其在深加工动物制品中的应用情况,包括在动物源性中药材、海产品、肉及肉制品、动物源性保健品以及皮革制品、动物标本等源性成分鉴别方面的应用,最后对DNA条形码技术鉴定物种的优势和不足以及发展趋势作了总结和展望。     

多重实时荧光PCR鉴别金钱白花蛇源性方法研究

目的用多重实时荧光聚合酶链式反应(多重实时荧光PCR)快速鉴别金钱白花蛇源性。方法以线粒体细胞色素C基因为目标靶基因,根据其特异性核酸序列设计引物和探针,通过优化引物及探针浓度、退火温度等PCR体系和条件,建立从活体材料和粉末制剂等中药材中检测金钱白花蛇源性的二重二色实时荧光PCR检测体系。结果通过检测市售15块金钱白花蛇药材,发现其中5块不含金钱白花蛇源性成分;10份金钱白花蛇粉末制剂中3份未检出金钱白花蛇成分;5份活体样本均为金钱白花蛇。检测结果与DNA测序结果一致。结论本研究建立的方法可用于金钱白花蛇源性的检测,能有效保障金钱白花蛇相关名贵中药及制品的安全性。     

利用12S rRNA基因标记鉴定鱼翅真伪

为检测鱼翅样本真伪及鲨鱼种属,通过提取送检鱼翅、鱼翅羹样本DNA,扩增其线粒体DNA上的用于动物种属鉴定的12S rRNA基因片段,并进行DNA测序和序列分析,测序结果在Gen Bank上进行BLAST搜索,与数据库中相关物种序列进行同源性分析。结果表明,在送检的23份样本中,18份鱼翅羹样本、2份粉丝状鱼翅、1份翅状鱼翅中均未成功提取到DNA,未扩增出目的基因片段,而从2份鱼翅样本中成功地提取到了基因组总DNA,并成功扩增出了12S rRNA基因片段,这2份样本的12S rRNA基因片段的碱基序列分别与黑边鳍真鲨(Carcharhinus limbatus)、斜锯牙鲨(Rhizoprionodon terraenovae)的同源性达到99%。对鉴定出含有鲨鱼成分的2份样本进行高温泡发处理,高温泡发实验表明,1份样本(22号)有明胶析出。研究证实,12SrRNA基因序列测定技术能准确、快速鉴定待检样本中是否含有鲨鱼成分,结合高温泡发时是否有明胶析出可综合判定鱼翅真伪。     

Novel approaches based on DNA barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species

Novel approaches were developed for the authentication of berry species. A specific focus was to identify bilberry (Vaccinium myrtillus L.) samples from different berry species which are frequently mixed in the markets. The method is based on DNA barcodes, i.e. standard regions of DNA, and high-resolution melting of amplicons. Regions of the internal transcribed spacer (ITS) and plastid DNA of eight wild berry species were sequenced, and primers for high-resolution melting (HRM) analyses were designed according to the sequence information. The developed gene-scanning method offers a rapid high-throughput method for the identification of wild berry samples. The analysis requires only DNA isolation and PCR steps and therefore it can be performed within a few hours. When needed, sequencing of the same regions can be used to ascertain the results. The method is easily adapted to other foodstuff raw materials as well.     

基于叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应PMA-qPCR 结合与高温裂解法高通量测序技术检测鉴定检测冷链食品中5多种 病原菌并构建金黄色葡萄球菌分子进化树完成病原菌分子进化树构建与溯源分析

目的 将PMA-qPCR、高通量测序以及分子进化树构建技术相结合,应用于冷链食品中多种病原菌的快速检测、种属鉴定、亲缘关系确定与溯源分析工作。 建立冷链食品中多种病原菌的快速检测技术并完成金黄色葡萄球菌的溯源分子进化分析工作。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌等等5种病原菌5种病原菌为作为研究对象, 应用PMA-qPCRPMA-qPCR技术结合高温裂解法作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对验证qPCR结果,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。研发病原菌活菌快速检测方法并开展冷链食品中病原菌的抽样调查。在建立稳定高效的检测方法后,为了获得冷链食品中病原菌污染水平、分布数据以及污染来源,研究开展冷链食品中病原菌的抽样调查检测工作。在检测出金黄色葡萄球菌等并分离病原菌后,进一步通过多位点采样以及16S rRNA测序构建了葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子生物进化树,完成菌株种属鉴定采用构建分子进化树的方法以及完成金黄色葡萄球菌等病原菌的溯源分析工作。结果 本研究应用建立的PMA-qPCR成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰感染,病原菌最低检测浓度可达到1×103 CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在16小时内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,本研究共从随机采集的751份冷链食品中检出6162株病原菌,病原菌总体检出率为8.13% (6162/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。通过分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄菌的污染来源并完成菌种种属定位。本研究还注意到经微生物检验一株疑似单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌株,该菌株后续通过测序、序列比对以及分子进化树构建确定为英诺克李斯特菌,这充分说明高通量测序的重要性以及方法验证的必要性。结论 研究在国内率先将PMA-qPCR、高通量测序与分子进化树构建技术相结合,应用于应用本研究方法可以快速有效检测5种冷链食品中的冷链食品中多种病原菌检测分析与种属鉴定,并完成金黄色葡萄球菌的溯源分析,方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,研究方法与成果可以为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供全新的思路与方法。     

Potential DNA markers as a rapid tracing tool for animal adulterants in vegetarian food

DNA-based methods are rapid, cost-effective and broadly applicable approaches for food authentication. Recently, the requirements for food safety and food integrity have increased with improved quality of life. Methodologies regarding food authentication based on DNA analysis are more commonly being used. With the increasing number of vegetarians, searching for markers for blind identification across kingdom species, such as an ingredient of animal origin in vegetarian food, would be valuable and attractive. Using bioinformatic analysis of an existing data source composed of 481 ultraconserved sequences, we selected 6 new candidate DNA segments that exist in most vertebrates but that do not exist in plants. Then, primers were designed for all of the candidate DNA markers, and DNA samples isolated from cow, pig, chicken, duck, soy bean, rice, pepper, wheat, sunflower and colza were amplified using each primer pair. None of the plant DNA samples generated a PCR product, while the DNA samples of animal origin were amplified successfully using 5 of the candidate segment primers; the 6th segment primer failed to amplify the DNA and was discarded. Moreover, a simulation experiment containing a plant product contaminated by an animal component indicated that the candidate DNA markers can be used for the rapid detection of animal adulterants in vegetarian products with a promising 5% detection limit. The identified candidate DNA markers for the blind identification of animal adulteration in vegetarian food may be highly desirable in the vegetarian food market, and these markers may facilitate the study of molecular technology for food authentication.     

种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分

建立适用于肉类罐头等长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分种属特异性PCR鉴别方法。通过使用猪、牛、羊、鸡、鸭的种属特异性引物,对5种动物的总DNA模板进行PCR扩增,得到分别为212、147、202、131、201 bp的扩增产物,将测序结果在美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information,NCBI)进行BLAST比对确认实验的准确性,并对市售罐头样品进行检测。该方法 5种动物引物种属特异性良好,对猪、牛、羊、鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%。在对市售肉类罐头样品的检测中,6.6%样品与标签标注结果不符。该方法操作简便,成本低,结果准确可靠,可广泛用于肉类罐头食品和长时间高温加工食品中猪、牛、羊、鸡、鸭5种动物源成分的鉴别,具有十分广泛的实际应用价值。     

基于高通量测序技术的食源性病原体检测应用进展

高通量测序是DNA测序技术发展中里程碑式的突破。面对突然爆发的食源性病原体疫情, 食源性病原体检测正从传统的物理化学方法以及核酸扩增杂交技术向无需富集分离的高通量测序技术发展。高通量测序技术把食源性病原体看成一个整体, 直接对食品样本中的所有病原体进行全基因组测序, 得到病原体基因组数据, 并进一步通过生物信息学分析, 得到病原体的基因型、毒力和耐药性报告。高通量测序技术广泛应用于食源性病原体检测的难点在于对测序数据的准确分析, 但其在食源性病原体的快速检测、预防食源疫情传播和日常的食源疫情监测, 尤其是发现未知食源性病原体方面拥有巨大的潜力。本文主要对基于高通量测序技术的食源性病原体检测技术的原理、应用进行综述, 并介绍了现阶段面临的挑战和机遇。     

基于DNA条形码技术对常见石首鱼科鱼胶的物种鉴定

摘　要：目的　运用DNA条形码技术对常见石首鱼鱼胶进行物种鉴定。方法　通过对26份鱼胶样品基因组DNA提取，PCR扩增COI基因、测序，用BOLD物种鉴定系统，与数据库中已有鱼类序列进行比对分析，鉴定出各鱼胶的物种；根据Kimura双参数模型计算样品序列遗传距离，并将所得序列构建NJ和MP系统发育树，进行聚类分析。结果　26份鱼胶样品通过鉴定引物“Fish-F”、“Fish-R”均可实现扩增，条带清晰单一，扩增和测序成功率均为100%；BOLD鉴定结果显示，26份鱼胶样品中23份能够确定物种来源（相似性达98%以上），包括石首鱼科12属15种鱼类，且多数为外来物种，另外3份鱼胶可推测其近缘物种。此外，系统发育树聚类分析结果与物种鉴定结果一致。结论　目前石首鱼类鱼胶来源物种较多，且多为外来基原鱼种。DNA条形码技术与BOLD鉴定系统相结合，可对大部分鱼胶进行准确的物种鉴定。     

用通用引物扩增细胞色素b基因进行牦牛肉的鉴定

本研究的目的是建立牦牛和黄牛肉的基因水平鉴定方法。从牦牛、黄牛和四川几个地方黑山羊品种的肉中提取基因组DNA,采用一对通用引物扩增细胞色素b基因中一段长度为421bp的序列,并进行了克隆测序。结果显示,通用引物能很好地扩增不同动物细胞色素b基因,扩增片段序列在牦牛与黄牛之间存在差异较大,能用于这两种肉的鉴定;而在金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊之间差异非常小。本研究建立了PCR-RFLP方法鉴定牦牛和黄牛肉,这对于动物保护以及来源不明的肉类产品的区分具有实际应用价值。