ARTP-DES连续诱变选育高产ε-聚赖氨酸突变株

为提升小白链霉菌(Streptomyces albluus)产ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)能力,在常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)、硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)单因子诱变的基础上,采用ARTP-DES连续诱变。连续诱变条件:ARTP工作功率110 W,照射距离2 mm,照射时间为30、60、105 s;DES诱变体积分数0.6%,反应时间20 min。并改进一种快速筛选方法,结合链霉素抗性、亚甲基蓝透明圈及48微孔板培养,酶标仪快速测定ε-PL含量。结果表明:ARTP-DES连续诱变结合链霉素抗性正突变率可达40.8%,同时,获得1株遗传性能稳定的链霉素抗性突变株S. albulus AD-9,其ε-PL摇瓶产量为2.1 g/L,是出发菌株的2.1倍。通过研究高产菌株的生理特性,发现其在营养需求、发酵过程中菌球形态等都发生了变化。ARTP-DES连续诱变选育高产ε-PL菌株是一种高效选育手段。     

利用抗性筛选和基因组重排技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus M-Z18的摇瓶产量较低,仅为1. 60 g/L。利用抗性筛选和基因组重排技术对S. albulus M-Z18进行菌种选育以获得高产ε-聚赖氨酸菌株。通过引入巴龙霉素抗性到S. albulus M-Z18中,获得两株性状优良的菌株S. albulus P-1和S. albulusP-2,ε-聚赖氨酸产量分别为2. 20 g/L和2. 16 g/L,单位菌体ε-聚赖氨酸合成能力分别为0. 41g/g和0. 39 g/g,作为基因组重排的亲本菌株;运用正交实验优化实验条件,最终获得一株高产ε-聚赖氨酸的融合子S. albulus G12,产量为2. 73 g/L,相比M-Z18提高了70. 63%。     

纳他霉素高产菌株的选育及其发酵条件的研究

利用链霉素抗性突变选育纳他霉素高产菌株 ,即将经过紫外线诱变处理的纳他霉素(natamycin)产生菌褐黄孢链霉菌 (Streptomycesgilvosporeus)ATCC1 332 6菌株孢子涂布在含有链霉素最小抑制浓度 (0 6μg/mL)的培养基平板上 ,获得了 1 2 2株链霉素抗性突变株。其中纳他霉素产量高于出发菌株的有 1 3株。其中突变株SG 56的生产能力比出发菌株提高到 1 4 6 % ,研究了其发酵性能 ,优化了培养基组成和发酵工艺条件 ,使纳他霉素产量提高到 1 70 %。     

ε-聚赖氨酸高产菌株的诱变选育

ε-聚赖氨酸(ε - PL)是一种L- lysine同聚物,主要由链霉菌科和麦角真菌产生.但是,ε-PL野生菌株的生产能力较低,这一定程度上制约对它的进一步研究和利用.对于包括链霉菌在内的大多数细菌,ε- PL的前体物lysine一般是通过天冬氨酸途径合成的.这条途径中的第一个关键酶Ask活性会受到氨基酸终产物的调节.而且,天冬氨酸还可以反馈抑制上游磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶的活性.为了解除上述反馈调节,提高ε - PL产生菌的产量,我们利用(SG+ Gly+L- lysine+ AHV)复合抗性,筛选出一种高产菌株L9.最终,我们得到了一株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)L9,其摇瓶产量为0.69g/L,比出发菌株高13％.经代传稳定性研究证明其产酸量和抗性标记均可稳定遗传.     

氮离子入法筛选ε-聚赖氨酸高产菌株

研究氮离子注入法诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株.本文从土壤筛选的菌株TS02出发,通过注入不同剂量30 keV氮离子,辅以抗性平板法结合抑菌圈法,筛选出了一株ε-聚赖氨酸高产白色链霉菌(Streptomyces albulus)GC11.经多次传代实验结果表明GC11稳定性良好.摇瓶发酵培养24h,GC11抑菌圈直径为23.20mm,比TS02提高了1.32倍;5L自控发酵罐发酵培养72h,GC11ε-PL产量为4.21 g/L,比TS02提高了1.30倍,达到了提高ε-聚赖氨酸产量的目的.     

天然食品防腐剂ε-聚L-赖氨酸高产菌株的筛选

从土壤中分离放线菌,通过选择性培养方法定向筛选ε-聚L-赖氨酸的产生菌,利用分批发酵,确定了适合白色链霉菌发酵产生聚赖氨酸的培养基,比较了分离到的几株菌的赖氨酸、聚赖氨酸合成能力,确定了诱变育种的出发菌株;突变株的赖氨酸、聚赖氨酸的产量均有一定的提高,正向突变率较高;抑菌实验结果显示突变株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用明显。     

ε-聚L-赖氨酸高产菌株诱变选育

微生物发酵生产的广谱抗菌的多肽ε-聚L-赖氨酸(ε-PL),易被生物分解,对人体无害,具有广阔的应用前景,目前已作为保鲜防腐剂在食品加工中使用。本研究立足ε-PL菌株的诱变选育,以白色链霉菌H为出发菌株,利用钴60和ARTP对菌株进行复合诱变,最终选育出ε-PL高产菌株H1-2,突变菌株在10L发酵罐规模,ε-聚L-赖氨酸产量达到24.5g/L,比出发菌株产量提高了88.5%。     

MPMS诱变结合抗生素抗性选育多杀菌素高产菌株

采用多功能等离子体诱变系统(MPMS)对菌株ASAGF 13-8-1进行诱变,并通过链霉素、庆大霉素、利福平、氯霉素四种抗生素抗性筛选多杀菌素高产菌株。利用96孔板发酵培养结合生物检测的快速方法进行高产菌株高通量初筛,摇瓶发酵进行复筛。通过5轮复筛验证,获得1株产量较出发菌株提高28.68%且遗传稳定的突变菌14-2。比较MPMS诱变和MPMS诱变结合0.9μg/mL链霉素、14μg/mL庆大霉素、400μg/mL利福平、2μg/mL氯霉素的四重抗性筛选对出发菌株ASAGF 13-8-1的作用效果,结果显示MPMS诱变结合抗生素抗性筛选更有利于多杀菌素高产菌株的选育。     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量

为提高灰褐链霉菌（Streptomyces griseofuscus LS-6）的ε-聚赖氨酸（ε-poly-lysine,ε-PL）发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌（Brebvibacterium flavum S62）进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1 株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73 倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力（己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等）和胞内氨基酸含量（赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等）均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量（英文）

为提高灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus LS-6)的ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine,ε-PL)发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum S62)进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力(己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等)和胞内氨基酸含量(赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等)均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

小白链霉菌响应低pH胁迫的全局基因转录分析

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)的生产菌,且只能在pH 4.0左右环境下大量积累ε-PL,但目前关于小白链霉菌响应低pH胁迫的生理机制研究较少。借助比较转录组学,研究Streptomyces albulus M-Z18响应低pH胁迫的生理机制。在恒化培养的条件下,考察S.albulus M-Z18在pH 5.5和pH 4.0条件下的全局基因转录差异,并对差异基因进行GO和KEGG分析。相比于pH 5.5,pH 4.0条件下共检测出3 893个显著差异表达基因,其中有1 786个显著上调基因,2 107个显著下调基因。KEGG分析发现,S.albulus M-Z18在pH 4.0时增强了糖代谢中糖酵解途径的第三阶段、三羧酸循环、氧化磷酸化途径、戊糖磷酸途径的氧化阶段,减弱了戊糖磷酸途径的非氧化阶段;同时,削弱了细胞壁肽聚糖合成,但增加了肽聚糖交联速度,并增加了细胞膜不饱和脂肪酸、环丙烷脂肪酸的合成,提高了细胞膜脂肪酸的不饱和度;此外,减弱多数氨基酸的合成,增强了碱性氨基酸(组氨酸和赖氨酸)的合成;最后,还增强...     

组合抗生素抗性选育多杀菌素高产菌株

通过2种途径向菌株ASAGF W2引入链霉素、庆大霉素、利福平和氯霉素抗性,研究抗生素抗性筛选技术对选育多杀菌素高产菌株的作用效果。途径一是将4种抗生素的抗性通过含有抗生素的平板逐级引入,标记为非GYM组;途径二是将分离得到的抗性突变菌进行纯培养后通过抗生素平板引入下一种抗性,标记为GYM组,利用摇瓶发酵进行多杀菌素高产菌株的选育。结果显示非GYM组的方法是进行抗生素抗性筛选的较适途径;通过对高产菌株连续转接5次,最终获得4株遗传稳定的高产突变菌,其中突变菌13-8-1来自非GYM组,具有Str~(0.5)Gen~(10)双重抗性,多杀菌素平均发酵产量较出发菌株ASAGF W2提高了23.87%。利用抗生素抗性筛选技术选育多杀菌素高产菌株,简单易行且效果显著。     

Genome Shuffling Enhanced e-poly-L-lysine Production of a Recombinant Streptomyces sp. Feel-1

利用Genomeshuffling技术对1株融合重组菌Streptomycessp．Feel-1产ε-聚赖氨酸（8-PL）进行了育种研究。首先对Feel-1进行了甲基磺酸乙酯（EMS）诱变,以甘氨酸（Gly）和S-2-氨乙基-L-半胱氨酸（AEC）作为抗性指标进行筛选,得到4株正向突变株,ε—PL摇瓶产量分别为1．78g／L、1．89g／L、1．85g／L、1．86g／L,比原始菌株Feel-1（1．60g／L）分别提高了11．3％、18．1％、15．6％、16．3％;然后将这4株产量提高株作为出发菌库,采用双亲灭活法进行了3轮递推式原生质体融合（Genome shuffling）,最终得到了3株产量大幅提高的重组菌,摇瓶产量分别为2．42g／L、2．35g／L和2．37g／L,比原始菌株分别提高了51．3％、46．9％和48．i％;选择其中1株（G3—67）进行补料分批发酵,192h时ε-PL产量达到32．2g/L。     

棒状链霉菌F613-1的诱变及其发酵工艺优化

该实验旨在获得克拉维酸高产菌株,并通过发酵条件优化提高其产量。以棒状链霉菌（Streptomyces clavulans）F613-1为出发菌株,通过紫外和亚硝基胍（NTG）联合诱变及含链霉素固定培养基筛选并在对突变菌株添加发酵前体研究基础上,通过单因素试验和响应面法优化其摇瓶发酵条件。结果表明,成功筛选一株棒状链霉菌衍生菌株,克拉维酸产量较出发菌株提高19.9%;添加1.5%甘油和0.15%谷氨酸可大幅缩短突变株发酵时间;突变株前36 h时25 ℃培养,后37 h时29 ℃培养,发酵pH值为7,克拉维酸产量达5.44 g/L,较出发菌株提高了55.8%。棒状链霉菌高产菌株的摇瓶发酵条件优化效果显著,为进一步提高克拉维酸生产提供依据。     

四川泡菜中乳酸菌链霉素抗性与抗性基因的检测（英文）

目的探明四川泡菜中链霉素抗性乳酸菌及抗性基因的种类。方法利用含有8μg/ml链霉素的MRS初步分离泡菜液中的抗性乳酸菌,通过16S r RNA分析确定抗性乳酸菌的分类地位后,测定同种不同菌株对链霉素的MIC,并与欧洲食品安全官方机构(EFSA)建议的最低临界值比较确定抗性菌株;通过PCR扩增链霉素抗性基因str A、str B,aad A、aad E、ant(6)、aac(6')-aph(2')和aph(3')-Ⅲa,确定抗性菌株的抗性基因。结果分离到67株链霉素敏感性或抗性菌株,这些菌株分别属于Pediococcus ethanolidurans(36),Lactococcus garvieae(14),Lactobacillus buchneri(12),Lactobacillus acetotolerans(2),Lactococcus lactis(1)和Staphylococcus.spp(2)。其中Lactococcus garvieae、Lactobacillus acetotolerans、Lactococcus lactis和Staphylococcus.spp全部为抗性菌株,Pediococcus ethanolidurans中有抗性菌株20株、Lactobacillus buchneri中有7株。在抗性基因检测中,除Lactobacillus acetotolerans抗性菌株没有检测到被检基因外,其他5个种的抗性菌株中均检测到部分或全部抗性基因。str A和aph(3')-Ⅲa基因在除Lactobacillus acetotolerans外的被检菌株中均有检出,其检出率分别为50%-100%和21.4%-100%;str B基因在抗性菌株Pediococcus ethanolidurans,Lactobacillus buchneri,Lactococcus garvieae和Lactococcus lactis检测率分别为70%、42.9%、28.6%和100%;aac(6')-aph(2')基因仅在3株Pediococcus ethanolidurans、1株Lactobacillus buchneri、1株Lactococcus garvieae和Staphylococcus spp中检测到。aad A、aad E and ant(6)在所有抗性菌株中都没有检测到。总体而言,str A、str B和aph(3')-Ⅲa基因在链霉素抗性菌株中的检出率高于其他抗性基因。结论当前的研究结果表明:四川泡菜中存在链霉素乳酸菌抗性菌株,这些抗性菌株对四川泡菜存在潜在安全风险。     

四川泡菜中乳酸菌链霉素抗性与抗性基因的检测

目的 探明四川泡菜中链霉素抗性乳酸菌及抗性基因的种类。方法 利用含有8 μg/ml链霉素的MRS初步分离泡菜液中的抗性乳酸菌,通过16S rRNA分析确定抗性乳酸菌的分类地位后,测定同种不同菌株对链霉素的MIC,并与欧洲食品安全官方机构（EFSA）建议的最低临界值比较确定抗性菌株;通过PCR扩增链霉素抗性基因strA、strB, aadA、aadE、ant(6)、aac(6')-aph(2')和aph(3')-Ⅲa,确定抗性菌株的抗性基因。结果 分离到67株链霉素敏感性或抗性菌株,这些菌株分别属于Pediococcus ethanolidurans (36), Lactococcus garvieae (14), Lactobacillus buchneri (12), Lactobacillus acetotolerans (2), Lactococcus lactis (1)和Staphylococcus.spp (2)。其中Lactococcus garvieae、Lactobacillus acetotolerans、Lactococcus lactis和Staphylococcus.spp全部为抗性菌株,Pediococcus ethanolidurans中有抗性菌株20株、Lactobacillus buchneri 中有7株。在抗性基因检测中,除Lactobacillus acetotolerans抗性菌株没有检测到被检基因外,其他5个种的抗性菌株中均检测到部分或全部抗性基因。strA 和aph(3')-Ⅲa基因在除Lactobacillus acetotolerans外的被检菌株中均有检出,其检出率分别为50%-100%和21.4%-100%;strB基因在抗性菌株Pediococcus ethanolidurans, Lactobacillus buchneri, Lactococcus garvieae和Lactococcus lactis检测率分别为70%、42.9%、28.6%和100%;aac(6')-aph(2')基因仅在3株Pediococcus ethanolidurans、1株Lactobacillus buchneri、1株Lactococcus garvieae和Staphylococcus spp中检测到。aadA、aadE and ant (6)在所有抗性菌株中都没有检测到。总体而言,strA、strB和aph(3')-Ⅲa基因在链霉素抗性菌株中的检出率高于其他抗性基因。结论 当前的研究结果表明：四川泡菜中存在链霉素乳酸菌抗性菌株,这些抗性菌株对四川泡菜存在潜在安全风险。     

ε-聚赖氨酸产生菌的复合诱变筛选及其发酵培养基优化

以白色链霉菌FQ-9为出发菌株,首次利用(甘氨酸+L-赖氨酸+磺胺胍)复合抗性,进行"紫外-氯化锂"复合诱变,筛选出一株ε-PL产量达(0.668±0.0045)g/L的突变菌株FQC-23,产量提高了15.37%,且其遗传性稳定。然后在单因素实验的基础上,应用响应面分析方法,对其发酵培养基进行优化,最终确定最佳培养基为(g/L):葡萄糖46.1、酵母粉13.0、(NH4)2SO45.9、Mg SO4·7H2O 0.5、K2HPO40.8、KH2PO41.36、Fe SO4·7H2O 0.03、Zn SO4·7H2O 0.04,在此条件下,FQC-23的ε-PL产量达(1.090±0.0041)g/L,比出发菌株的产量提高了87.56%。     

高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的复合诱变选育研究

为了进一步提高ε-聚赖氨酸的产量,本实验以白色链霉菌SA为出发菌株,采取紫外照射复合氯化锂(15W,25s,0.5%LiCl)诱变选育及0.025mol/L亚硝酸诱变选育,得到一株具有遗传标记AEC的抗性突变高产菌株UN2-71,在液体摇瓶发酵培养基中,ε-聚赖氨酸产量达到1.64g/L,较出发菌株提高57.7%.     

柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌发酵产ε-聚赖氨酸的影响

本文研究了不同生长期在培养基中添加柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌生长及产ε-PL的影响,结果表明添加不同浓度柠檬酸钠对菌体生长的影响不明显,但对白色链霉菌ε-PL合成有正向促进作用。0 h添加2 g/L的柠檬酸钠可获得最大的ε-PL产量0.92g/L。随着柠檬酸钠浓度的增加,ε-PL产量先增加后降低。在0 h添加2 g/L柠檬酸钠并在36 h添加300μg/L生物素,发酵72 h后菌体干重和ε-PL产量分别达到了7.86 g/L和1.10 g/L,是空白对照组的1.30倍和1.93倍,说明外源添加柠檬酸钠和生物素对白色链霉菌发酵生产ε-PL有促进作用。     

过表达L-赖氨酸合成途径关键基因和ε-聚赖氨酸合成酶基因对ε-聚赖氨酸合成的影响

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是小白链霉菌(Streptomyces albulus)产生的一种具有广谱抑菌活性的次级代谢产物,作为一种新型天然食品防腐剂在食品工业领域获得了广泛应用。通过代谢工程手段提高ε-PL生产菌的产物合成能力是降低ε-PL生产成本的有效手段,但目前关于ε-PL生物合成的关键代谢节点和调控机制还不清晰,因此还缺乏有效的靶基因。该研究基于文献挖掘了5个L-赖氨酸合成途径关键基因pyc(丙酮酸羧化酶基因)、ppc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)、zwf(6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因)、dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶基因)、lysA(二氨基庚二酸脱羧酶基因)和1个ε-PL合成酶基因(pls),并借助基因过表达手段,寻找影响ε-PL生物合成的关键靶基因。研究结果发现,过表达ppc、pyc和pls能够有效促进S.albulus WG608合成ε-PL。在补料分批发酵方式下,过表达菌株OE-ppc、OE-pyc和OE-pls的ε-PL产量较出发菌株S.albulus WG608分别提高2.8%、9.9%和16.3%,单位菌体合成能力分别提高12.7%、2...