冰冻蚀刻胶体金标记技术

冰冻蚀刻技术主要的优越性之一是可以显示出镶嵌在细胞膜内的蛋白质颗粒,而对这些种类,数量繁多的膜内微粒的定性与定量研究,则是近几年刚刚建立的一个重要的电镜新技术。本实验用直径5nm的胶体金一羊抗兔抗体和直径20nm的胶体金一蛋白A的复合物,以及抗辛德毕斯病毒(sbv)表面糖蛋白E和抗sbv的抗体及抗水泡性口炎病毒(vsv),表面糖蛋白的抗体,分别标记了sbv或vsv感染的BHK—21单层细胞,经固定和甘油处理后,再把长有细胞单层的盖玻片小心裁成大小1～2mm的小块,在Balzars冰冻蚀刻仪中断裂、喷镀复型膜。仅用蒸馏水将复型膜连同细胞碎片漂起,即可捞在400目的载网上。     

病毒感染单层细胞的免疫标记与断裂技术

用抗Sindbis病毒(SbV)囊膜蛋白E_1和E_2的抗体及抗Vesicular Stomatitis病毒(VSV)囊膜蛋白(G蛋白)的抗体分别对病毒感染的BHK-21细胞进行胶体金免疫标记,然后按冰冻蚀刻的制样程序制备铂-碳复型膜以研究病毒囊膜蛋白在细胞质膜上的定位与分布。本文扼要地介绍了这一技术的操作过程,同时,结合我们自己的工作对该技术的要点及其应用进行了讨论。     

G—17胃泌素细胞的免疫电镜观察

本文用兔抗人胃泌素G—17抗体标记胃G—17胃泌素细胞,分泌颗粒多数含低或中度嗜锇性粒芯,葡萄球菌A蛋白胶体金(PAG)主要标记在此型颗粒上;少数粒芯呈高度嗜锇性,此型颗粒仅少数被PAG标记。并就此结果进行初步讨论。     

胶体金免疫电镜技术检测番茄环纹斑点病毒

本实验利用胶体金免疫电镜技术检测番茄环纹斑点病毒（ tomato zonate spot virus, TZSV）,分别以TZSV的N 蛋白多克隆抗体及TZSV的Gn蛋白多克隆抗体为一抗,然后以胶体金标记羊抗兔IgG?gold（10 nm）为二抗对病毒进行胶体金标记,电镜观察用TZSV Gn蛋白抗体标记的胶体金颗粒能很好地结合到病毒粒体上。结果表明该方法可以实现对TZSV更为准确可靠地检测。     

家蚕质多角体病毒RDRP的免疫电镜定位研究

以原核表达BmCPV RDRP重组蛋白为抗原制备的兔抗血清为一抗,直径15nm山羊抗兔IgG 胶体金为二抗。应用3%多聚甲醛 0 1%戊二醛混和固定液、K4M低温包埋剂和紫外光聚合制备的样品进行免疫电镜观察,结果感染BmCPV(C)病蚕的中肠柱状细胞中,游离和病毒多角体中BmCPV的病毒粒子均能结合胶体金颗粒,平均标记率为25%左右,认为BmCPV(C) RDRP基因编码的蛋白应为BmCPV病毒的结构蛋白,位于病毒的衣壳上。其中一抗的使用浓度为1∶200,二抗的使用浓度为1∶40,可以获得较好的免疫标记效果和较少的非特异性标记。     

辛德比斯病毒6K蛋白在宿主细胞内的分布

6k蛋白是Sindbis病毒(SbV)26S基因组编码的一个仅有55个氨基酸的小分子蛋白质,其生物学功能甚至在细胞内的分布至今尚不清楚。最近在M.Schlesinger实验室中用人工合成的6k多肽得到抗6k蛋白的抗体,使我们的上述工作得到进行。本实验用直径20nm的胶体金—proteinA和直径为5nm的胶体金—羊抗兔抗体的复合物,用常规的免疫电镜技术,先后标记了SbV感染的整装细胞及用于冰冻蚀刻的样品,以观察6k蛋白在细胞表面的分布,又标记了Triton×100处理的整装细胞以研究6k蛋白与细胞骨架的关系。同时还标记了低温包埋剂(LK4M)     

辛德毕斯病毒囊膜蛋白的免疫标记

辛德毕斯病毒(Sindbis Virus,简称SbV)是最小的有囊膜的RNA病毒之一(图1),其囊幕含有二种病毒特异的囊膜蛋白(图1箭头)。病毒囊膜蛋白是在宿主细胞粗面内质网上合成的,经高尔基体加工后转运到细胞质膜上。研究SbV囊膜蛋白在细胞膜上的分布有助于进一步了解病毒的成熟与释放过程及其机制。我们曾参照P.Pinto da Silva的方法用抗病毒囊膜蛋白的抗体对SbV感染的细胞进行胶体金免疫标记,然后制备冰冻断裂复型样品,获得了宿主细胞质膜EF面复型与ES面的标记金颗粒的叠加图象(图2),进而我们探索了标记一复型技术和获得PF面复型与PS面标记金颗粒的叠加图象的方法,前者更有效地显示SbV囊膜蛋白在细胞质膜上的分布(图3),后者则可以把细胞内的免疫标记与冰冻蚀刻技术相结合,以对膜内微粒中的SbV囊膜蛋白进行定性定位的研究(图4),从而在一定程度上弥补了P.Pintoda Silva方法的不足。     

用冷冻蚀刻技术研究几种病毒的形态发生

几种大型病毒的冷冻蚀刻研究(痘苗病毒、山羊痘病毒和疱疹病毒等)在我国已有报导。本文拟报导三种中小型病毒的形态结构及形态发生过程。<1>水泡性口炎病毒(vsv)、属弹状病毒科,有囊膜的病毒,大小70×170nm;<2>辜德毕斯病毒(sbv),属披盖病毒科,有囊膜的病毒,直径50—60nm;<3>人腺病毒,属腺病毒科,无囊膜的病毒,直径约70nm。在腺病毒感染的宿主细胞核内,可观察到处于不同装配和成熟阶段的病毒粒子(图A、左不)。在VSV和sbv感染的宿主细胞质中和细胞质空泡内可观察到病毒核衣壳装配的过程,尤其在宿主细胞的表面更清楚地显示出病毒以出芽的方式向细胞外释放的各个细节。(图A     

免疫毒素细胞内传递途径的免疫金双标记研究

应用免疫金双标记技术对免疫毒素在细胞内传递途径进行了亚显微形态研究。采用5nm胶体金颗粒标记羊抗鼠、15nm胶体金颗粒标记兔抗蓖麻毒素以及免疫毒素(由抗CD_5、CD_2、CD_8及抗金T细胞的单抗DS27、JN205、P218、P81和蓖麻毒素构成),对免疫毒素与Molt-4细胞(人T淋巴细胞系)的相互作用进行了动态观察及超微结构定位。电镜下,在不同时期的实验动态观察中,两种不同粒径的金颗粒相伴随,共同定位于细胞膜及其突起表面、细胞膜被膜小凹(Coated pit)中,随后进入细胞内,定位于内吞小体(endosome)及其所属小管、小泡、多泡小体及溶酶体,并迅速到达跨高尔基氏复合体网状系统(trans-Golgi network)。实验中还观察到细胞膜表面有分布     

银增感免疫电镜的效果观察

胶体金免疫民镜技术是利用抗原和抗体特异性结合，在电镜下检测与抗体结合电子密度高的胶体金，确定抗原位置。因此已成为研究细胞化学的重要技术，得到广泛应用。但被检的胶体金粒子直径一般在10nm左右，很难在低倍下、大视野观察不同细胞的标记情况，为此，增大胶体金颗粒十分必要。     

应用电镜原位分子杂交技术对腺病毒DNA在宿主细胞内进行定位

以Biotin标记的dATP(Bio-7-dATP)通过缺刻翻译(Nick Translation)制备腺病毒的基因组探针,建立了电镜原位杂交技术,并研究腺病毒感染的HeLa细胞内病毒DNA的分布。结果表明,免疫胶体金颗粒特异地标记在腺病毒感染的细胞核内,并且在核内呈区域性分布。整装抽提后的细胞原位杂交结果显示出,胶体金颗粒呈族状马串珠状结合在核骨架上,从而在形态学上证实了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系。     

应用胶体金标记免疫电镜技术对牛白血病病毒的研究

牛白血病病毒系为逆转病毒科肿瘤病毒亚科C型肿瘤病毒属哺乳动物C型肿瘤病毒亚属成员。该病毒对养牛业危害极大,而且对国济民生也有莫大影响。因此,研究在病毒,防制牛白血病具有深远意义。本试验目的旨在应用免疫胶体金技术进一步确定该病毒的抗原位置。本试验利用牛白血病病毒感染羊胎肾细胞(FLK)作为原材料。羊抗牛白血病病毒血清和免抗羊IgG分别为第一和第二抗体,利用鞣酸一构椽酸三钠还原法制备约5nm粒径的胶体金。按文献报导方法进行标记,常规方法制     

单抗—药物偶合物对HL60细胞特异性结合与内化的研究

我们在电镜水平上用胶体金标记技术研究H198单抗与柔红霉素(DNR)偶合物(HI98-DNR-Au)对HI98抗元的特异性结合和内化作用。结果表明HI98-DNR-Au与HL60细胞在4℃孵育60分钟后,可见金颗粒与100％HL60细胞的表面膜结合;在上述条件孵育后,然后再在37℃中孵育15分钟,金颗粒可在30％的细胞胞浆内以及8％的核内出现;胞浆内的金颗粒可随孵育时间的延长(30’,60’,120’和240’)而明显增加,而表面膜上的金颗粒则随时间的延长而减少,金颗粒通过吞饮泡的形成而内化。在吞饮泡内簇集的金颗粒可融合成金斑块或破碎成细粒,一些金颗粒通过吞饮泡的膜或胞膜进入胞浆以及通过核膜而进入核内。但作为对照,HI98-DNR-Au与CEM细胞以及葡萄球菌A-蛋白     

用胶体金显示PbGv在脂肪体中的免疫化学定位

胶体金作为标记物最早由 Faulk和 Toylor( 1 971 ) Romano等 ( 1 974)用于电镜免疫细胞化学研究。近年来胶体金探针已成为定位和分析多种蛋白质、多肽、多糖的有力工具。特别是在抗原酶及激素等物质的细胞免疫化学定位中更加显示了其独特的威力。利用 Ig G的双价性 ,它的一臂可结合到事先包被有抗原的胶体金上 ,也可以把抗体分子包被在胶体金上 ,对细胞内的抗原进行定位。昆虫病毒在感染细胞中有很强的能力。其中杆状病毒包含体蛋白的复制量可达到死虫的2 0 %是当前所了解的真核细胞中表达量最大的病毒蛋白质。为了了解这蛋白合成和代谢的…     

细胞内病毒抗原定位的低温包埋及胶体金标记

本文报告使用低温包埋剂Lowicryl K4M对感染细胞进行低温包埋和制作超薄切片,用包被SPA或IgG的胶体金作为第二抗体,采用间接法对两种RNA病毒(脊髓灰质炎病毒和轮状病毒)和两种DNA病毒(单纯疱疹Ⅰ型病毒及SV_(40))在感染细胞中作了定位标记实验。将结果同常规环氧树脂Epon 812包埋的感染细胞包埋前穿透标记和包埋后超薄切片标记进行比较。常规包埋法对细胞超微结构保存良好,但由于高温聚合对病毒抗原活性破坏较大,不能获得理想的金标记结果。使用皂角甙(Saponin)改变细胞膜进行包埋前穿透标记,虽能获得特异性标记,但皂角甙对细胞膜结构破坏严重,不利于进行病毒与细胞相互作用关系的研究,且作用条件及时间不易掌握。以上缺点可通过使用低温包埋法得到解决。     

低丰度蛋白Mlo的免疫金标记技术研究

小麦Mlo蛋白是一种低丰度蛋白。本文利用Mlo蛋白的2种抗血清对不同标记条件下的免疫胶体金标记情况进行了研究。结果表明,一抗结合时间对标记结果有影响,60min的标记时间对Mlo蛋白定位比较合适;小麦Mlo蛋白11．2抗血清对Mlo蛋白的标记效果要比CT抗血清的标记效果好;IgG胶体金探针要比蛋白A胶体金探针更适合于对低丰度蛋白的检测。     

采用免疫胶体金标记结合负染色电镜技术对体外组装的中间纤维定性

将免疫胶体金标记与电镜负染色技术相结合，清晰显示体外组装的波形纤维具有１０ｎｍ中间纤维结构特征，抗波形纤维蛋白－金颗粒特异地标记在波形纤维上，用抗波形纤维蛋白－金颗粒对体外组装的微管进行标记则呈阴性反应。实验结果表明将免疫胶体金标记与电镜负染色技术相结合可以同时显示体外组装的细胞骨架纤维的精细结构和蛋白属性。     

辛德毕斯病毒（Sindbis Virus）成熟过程的电镜研究

辛德毕斯病毒(Sindbis Virus,以下简称 SbV)属于披盖病毒科,是最小结构最简单的有囊膜的病毒之一,其结构蛋白仅有三种即衣壳蛋白、囊膜蛋白E_1和E_2。病毒的核衣壳在宿主细胞的细胞质中装配,然后转移到细胞质膜下,以出芽的方式披上一层囊膜,发育成为成熟的病毒粒子,出芽成熟过程的动力来自于核衣壳上的衣壳蛋白与细胞质膜上的病毒囊膜蛋白的相互作用。SbV的这种成熟模式十几年前就已提出并得到后来的一些电镜观察结果的支持。近几年来分子生物学的研究结果进一步表明:病毒成熟过程是囊膜蛋白E_2(一种跨膜蛋白)在细胞质中的部分(C末端)与衣壳蛋白相互作用的结果。     

人红细胞老化过程中膜表面唾液酸变化的免疫AFM研究

分离人外周血的轻龄和老龄红细胞,采用麦胚凝集素和胶体金对红细胞表面的唾液酸残基进行细胞化学标记,然后在AFM下成像并进行数据分析.结果显示,老龄红细胞膜表面胶体金标记的颗粒数量明显低于轻龄红细胞表面,两者之间有显著差异.推测红细胞老化过程中细胞膜表面唾液酸含量的变化可能与老化细胞的处理机制有关.免疫胶体金标记结合原子力显微镜可在纳米尺度对膜受体蛋白进行定位和定量研究,拓展了原子力显微镜在生命科学领域的应用.     

免疫金银扫描电镜法观察血细胞膜的谷胱甘肽过氧化物酶及泛素肽的方法

免疫胶体金标记扫描电镜法是70年代后期发展起来的新技术,对检查细胞膜的抗原分布和变化有特殊的优点,但该法要求较高活性大颗粒(50nm)胶体金和高分辨扫描电镜,目前我们无这种条件,为此,我们将光镜的免疫金银法过渡到扫描电镜。另外,为解决血浆对血细胞的影响,采用了试管内免疫胶体金一次性染色法,用这种方法检查了血细胞膜谷胱甘肽过氧化物酶和泛素肽(Ubiqnitin)效果良好。经各种对照(去抗体;去胶体金;单纯硝酸银;免疫胶金透射电镜检查;)证明扫描电镜下颗粒物是特异性免疫颗粒。说明免疫金银扫描电镜法有应用价值。主要方法步骤是:1.取适量静脉血注入试管,加2％多聚甲醛一戊二醛液与其混匀,在4℃下固定1小时;2.用TBS缓冲液反复冲洗;3.其余程序同免疫金常规