大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

人胰岛素样生长因子-1的融合表达及纯化

目的利用原核表达系统融合表达人胰岛素样生长因子-1(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1),并进行纯化及鉴定。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对hIGF-1天然基因序列进行同义突变,并人工合成,PCR扩增后,克隆至pET48b(+)载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白Trx A-hIGF-1经Ni2+亲和层析进行纯化,纯化产物经肠激酶酶切后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET48b-Trx A-hIGF-1经菌落PCR及测序证实构建正确;表达融合蛋白相对分子质量约为26 000,表达量约为菌体总蛋白的40%,主要以可溶形式存在于菌体裂解上清中,可溶性蛋白占总目的蛋白的比例不低于90%,纯化后纯度不低于90%,蛋白浓度为0.5 mg/ml;纯化的Trx A-hIGF-1融合蛋白可被肠激酶切割为相对分子质量约为8 000的hIGF-1蛋白和18 000的Trx A蛋白,hIGF-1蛋白可与兔抗hIGF-1多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了hIGF-1融合蛋白,为其生物学活性的研究及规模化生产奠定了基础。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

大肠癌相关基因PGDH原核表达质粒的构建及表达

目的构建15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达PGDH蛋白。方法以人正常大肠黏膜组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,转化E.coliDH5α,经温控诱导表达,并经Ni2+-NTA亲和层析纯化,目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组质粒pBV220-PGDH-His6经PCR及酶切鉴定,证明质粒构建正确。经温控诱导后,可表达出相对分子质量约为29 000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3 h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。Western blot验证了表达蛋白的特异性。纯化后目的蛋白纯度大于95%。结论已成功构建PGDH原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了PGDH蛋白。     

内含肽介导的重组人干扰素α2a的原核表达及其生物学活性

目的原核表达内含肽介导的重组人干扰素α2a(rhIFNα2a)融合蛋白,并检测其生物学活性。方法以质粒pBV220-IFN-α2a为模板PCR扩增rhIFNα2a基因,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽Ssp DnaB基因下游的多克隆位点,构建重组表达质粒pTWIN1-rhIFNα2a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析,并对裂菌上清的生物学活性进行测定。结果双酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入表达载体中;rhIFNα2a蛋白的相对分子质量约44 300,表达量占全菌总蛋白的30%,在裂菌上清中的表达量占目的蛋白的25%,可与小鼠抗hIFNα单克隆抗体特异性结合;裂菌上清中rhIFNα2a蛋白的活性为5.57×107IU/ml,表明该重组蛋白具有良好的IFN抗病毒活性。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了具有生物学活性的可溶性重组rhIFNα2a与内含肽Ssp DnaB融合蛋白,为大量生产IFNα2a提供了新的思路。     

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P_2C基因的克隆与表达

目的克隆并表达柯萨奇B4病毒(CVB4)非结构蛋白P2C基因。方法提取CVB4总RNA,RT-PCR扩增P2C基因,克隆入pUCm-T载体中,进行酶切和测序鉴定。双酶切重组质粒pUCm-T-P2C,将P2C基因片段定向亚克隆至原核表达载体pMAL-C2中,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果RT-PCR扩增得到987bp的基因片段,测序结果与GenBank公布的P2C基因序列一致。pMAL-C2-P2C经双酶切鉴定,证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约78000,表达量约占菌体总蛋白的25%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆并表达了CVB4P2C基因,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达

目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。     

X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。     

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白。方法利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100%;SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43000,表达量占菌体总蛋白的20%以上;Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合。结论已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料。     

甘油脱水酶α亚基基因的克隆、表达及纯化

目的克隆甘油脱水酶α亚基基因,构建表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用PCR技术克隆甘油脱水酶α亚基gldA基因,并将其重组到含组氨酸标签的表达质粒pET-32a(+)中。将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化,并进行Western blot分析及活性检测。结果重组表达质粒pET/gldA经酶切鉴定及序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达,融合蛋白相对分子质量约81000,与预期大小一致。经Western blot分析,纯化蛋白能与6-Histidine抗体产生特异性免疫反应。α亚基经检测,未显示活性。结论已成功获得甘油脱水酶α亚基蛋白,为进一步研究其生物学性能奠定了基础。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

翻译调控肿瘤蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA为模板,PCR扩增TCTP基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。His Trap FF层析柱纯化重组蛋白后,进行Western blot鉴定。结果克隆的目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为20 000,主要以包涵体形式表达;纯化后纯度为80%,可与兔抗人TCTP多克隆抗体特异性结合。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了TCTP,为进一步研究其在肿瘤等疾病发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。     

百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达

目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序列S1′。将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1′,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果S1′基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达蛋白的相对分子质量约17400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1 N-端主要抗原基因的原核表达

目的　获得序列正确的人乳头瘤病毒 (HPV) 16型L1N -端主要抗原基因 ,构建其原核表达载体 ,并进行诱导表达。方法　采用PCR法从宫颈癌组织中获得HPV16型L1N 端主要基因重组表达质粒 ,转化E .coliDH5α ,4 2℃诱导表达 ,Westernblot分析表达产物。结果　获得了序列正确的人乳头瘤病毒HPV16型L1N -端主要基因 ,相对分子质量约为 5 10 0 0。表达蛋白能与乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生抗原抗体反应。结论　已成功构建HPV16型L1N -端主要基因表达载体 ,并获得有效表达。     

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。     

二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段的基因克隆和原核表达

目的克隆人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段并构建其原核表达系统。方法用PCR法从人巨细胞病毒AD169株基因组DNA中扩增gB/AD-1片段并克隆至pGEM-T载体,酶切后,亚克隆至表达载体pET-15b,构建重组表达质粒pET-15b/gB/AD-1,并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析一步纯化,并用Westernblot鉴定。结果gB/AD-1蛋白表达量达到35%。表达产物经纯化后,纯度大于95%。经Westernblot检测,表达产物与CMV阳性人血清发生特异性反应。结论已成功构建重组表达载体pET-15b/gB/AD-1,并在大肠杆菌中高水平表达gB/AD-1。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1基因的原核表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1(ATP-dependent Clp proteolytic subunit 1,ClpP1)基因重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中PCR扩增ClpP1基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,转化大肠埃希菌B21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约35 000,可与鼠抗His单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpP1蛋白在MTB中的生物学特性奠定了基础。