重组传染性法氏囊病病毒VP2/VP243基因表达及保护性和免疫原性

目的在重组鸡痘病毒中表达传染性法氏囊病毒 VP2/VP243基因,并研究表达产物的保护性和免 疫原性。方法以 FPV 282E_4株 TK基因为侧翼,分别将鸡法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV) VP2 和VP243目的基因克隆到牛痘病毒A型包涵体(ATI)和痘苗病毒P7.5复合型启动子下游,构建成2个重组表达质 粒,命名为pUTALacVP和pUTA LacVPO。用这2个质粒转染CEF细胞,用X-gal染色法筛选出2株重组病毒vUTA lacVP2和 vUTALacVP0。用这 2株病毒免疫 1周龄 SPF鸡,以常规疫苗为对照。结果 ELISA、SDS-PAGE和 Western blot表明表达产物可与IBDV特异性多克隆抗体反应,并诱导鸡保护性抗体。在使用vvIBDV攻击前,对照组抗体水 平显著高于实验组。但攻击5 d后,实验组抗体水平明显升高。结论vUTALacVP2和 VPO在 CEF细胞中实现了高 效表达,但重组疫苗的保护率低于常规疫苗。     

表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因重组鸡痘病毒的构建与鉴定

目的构建表达猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组鸡痘病毒。方法将PCV2ORF2基因插入到转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTA-ORF2,将该质粒与鸡痘病毒野生株282-E4共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。经BrdU加压筛选重组鸡痘病毒,采用RT-PCR和间接免疫荧光法进行鉴定。结果重组鸡痘病毒感染的CEF经RT-PCR可扩增出260bp的目的基因,间接免疫荧光检测可见特异性黄绿色荧光,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建了1株表达PCV2ORF2基因的重组鸡痘病毒。     

HIV-2 Gp105基因重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的　研制预防HIV -2的重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法　将HIV -2Gp10 5基因插入鸡痘病毒转移载体pUTA2复合启动子的下游 ,构建鸡痘病毒转移载体pUTA2 Gp10 5。将该重组质粒与鸡痘病毒 (FPV) 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,进行同源重组。通过 3次BrdU加压筛选 ,以PCR、RT PCR、IFA和Westernblot鉴定重组病毒。结果　从重组鸡痘病毒的基因组和总RNA中能扩增出大小为 6 5 3bp的目的基因 ;感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应 ;表达产物与人HIV- 2血清发生阳性反应 ,目的蛋白相对分子质量约为10 5 0 0 0。结论　成功获得 1株重组鸡痘病毒 ,可正确表达HIV 2Gp10 5基因。     

HIV-1 env基因在重组鸡痘病毒中的表达

在以鸡痘病毒复制非必需区TK基因为侧翼构建的载体 (插入有 16个串联的突变型痘苗病毒P7 5启动子和牛痘病毒A型包涵体晚期启动子及LacZ报告基因 )中的复合启动子下游 ,分别插入编码人免疫缺陷病毒(HIV)Ⅰ型外膜蛋白的env基因和中国株HIV 1gp12 0基因 ,通过与野生型鸡痘病毒的同源重组 ,X gal显色挑斑 ,获得 2株重组病毒vUTA - 2f- 16LE和vUTA - 2f- 16LG。经Dot-ELISA、免疫荧光试验、SDS -PAGE和Westernblot检测表明 ,2株重组病毒均能表达gp16 0和gp12 0 ,相对分子质量分别为 16 0 0 0 0和 12 0 0 0 0。经小鼠免疫试验其血清中抗gp12 0抗体A值和脾脏CD4+ /CD8+ T淋巴细胞比值均高于对照组 (P <0 .0 1) ,说明由重组病毒表达的Env蛋白和Gp12 0蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析

目的表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性。方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Westernblot检测。结果阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%。Westernblot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应。结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性。     

表达PRRSV GP5、GP3和猪IL-18的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

目的研制安全有效的预防猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组鸡痘病毒活载体疫苗。方法将PRRSV长春株的GP5和GP3基因插入到含有猪IL-18基因的鸡痘病毒转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL-IL-18-GP5-GP3。将该重组质粒与鸡痘病毒(FPV)282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过3次BrdU加压筛选,经PCR、RT-PCR和IFA方法鉴定重组病毒。结果从重组鸡痘病毒基因组和总RNA中扩增出340bp的目的基因片段,感染重组病毒的CEF细胞与特异性荧光抗体发生阳性反应,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建1株重组鸡痘病毒,并可正确表达PRRSVORF5/ORF3基因。     

中国流行株HIV-1Gag蛋白在重组鸡痘病毒的表达及鉴定

目的 以鸡痘病毒为载体,表达ＨＩＶ－１　Ｇａｇ蛋白,进而研制ＡＩＤＳ疫苗。方法 以鸡痘病毒２８２Ｅ４株 非必需区ＴＫ基因为侧翼,插入ＶＶ突变型Ｐ７．５串联启动子和牛痘病毒Ａ包涵体晚期启动子与２０个串联的突变型 早期痘苗病毒Ｐ７．５启动子组成复合启动子及ＬａｃＺ报告基因构建重组表达质粒ｐＵＴＡＬ。在ＡＴ１－Ｐ７．５复合启动子 下游,插入编码中国流行株 ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因（Ｂ亚型）,构建了重组表达质粒ｐＵＴＡＬ－Ｇａｇ。重组质粒Ｇａｇ与ＦＰＶ共 转染ＣＥＦ细胞,进行同源重组。通过ＢＵｄＲ加压筛选,Ｘ－ｇａｌ染色,获得重组鸡痘病毒ｖＵＴＡＬＧ,用于感染ＢＨＫ细胞 并免疫小鼠。结果　经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测,重组病毒表达了Ｇａｇ蛋白相对分子质量分别为５５０００、４８０００、２４０００和 １７０００,为Ｇａｇ蛋白的Ｐ５５、Ｐ４８、Ｐ２４和Ｐ１７蛋白。重组病毒免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。结论　所重组的病毒 成功地表达了目的蛋白并进行了正确加工。     

重组口蹄疫鸡痘病毒vUTAL3CP1的构建及其遗传稳定性和免疫原性

目的构建重组口蹄疫鸡痘病毒,并检测其遗传稳定性和免疫原性。方法将口蹄疫病毒(FMDV)的衣壳蛋白前体P1-2A和蛋白酶3C基因插入到鸡痘病毒表达载体中,构建重组鸡痘病毒转移载体pUTAL3CP1,并与鸡痘病毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过BrdU加压筛选获得重组鸡痘病毒vUTAL3CP1。重组病毒在CEF中连续传30代,分别进行毒力和基因检测,并免疫BALB/c小鼠,检测特异性抗体和中和抗体。结果重组鸡痘病毒经RT-PCR可扩增出目的基因;特异性荧光抗体反应呈阳性;在CEF中连续传30代,毒力稳定,基因未发生缺失和变异;免疫小鼠能产生较高水平的FMDV特异性抗体和中和抗体。结论已成功构建重组口蹄疫鸡痘病毒,且具有良好的遗传稳定性和免疫原性。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1基因重组MVA病毒的构建及鉴定

目的研制预防人乳头瘤病毒(HPV)感染的重组修饰的Ankara痘病毒(MVA)活载体疫苗。方法将HPV16L1基因插入MVA病毒转移载体psc11M2的P7·5启动子的下游,构建转移质粒psc11M2-L1,与MVA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过9轮蓝斑筛选,以PCR和Westernblot鉴定重组病毒。结果获得的含目的片段的重组MVA病毒,表达产物与鼠抗人HPV16L1抗体发生阳性反应,目的蛋白相对分子质量约为55000。结论已成功地构建了可正确表达HPV16L1基因的重组MVA病毒株。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建及其原核表达

目的构建鸡新城疫(ND)强毒株多裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法奠定基础。方法人工合成一段包含4种不同NDV强毒株裂解位点的基因Fe(F prote in multitude epi-position),其中各裂解位点之间用Linker(GGGGS)使其串联,然后进行2倍和4倍拷贝,并定向克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28a(+)/4Fe,进行表达和Western blot鉴定。结果构建的原核表达重组质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28 a(+)/4Fe测序正确。Western blot检测结果表明,2Fe、4Fe蛋白均与新城疫强毒株F48E9阳性血清呈阳性反应,而与新城疫弱毒株V4阳性血清呈阴性反应。结论已成功构建NDV强毒株F蛋白裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法提供理论依据。     

新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

目的 采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果 表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。     

甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达

目的构建含有甲型流感病毒HA基因的核酸疫苗表达载体,转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。方法将甲型流感病毒New Caledonia/20/99(H1N1)接种鸡胚后,收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增HA基因。经亚克隆后获得质粒pMD-T/HA,酶切鉴定后测序,将其与质粒pVAX1分别双酶切后连接,构建甲型流感病毒表达载体pVAHA。脂质体法转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。结果扩增出1700 bp片段,与预期的HA基因大小相符,测序结果与GenBank报道一致,酶切鉴定表明甲型流感病毒表达载体pVAHA构建正确,Western blot检测证明了流感病毒HA蛋白的表达。结论已成功构建了甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体pVAHA。