牛凝乳酶基因的克隆与表达

为了获得大量高纯度高活性的凝乳酶制剂,采用基因工程方法,从犊牛皱胃黏膜细胞中克隆得到凝乳酶基因,然后将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)-内含肽(intein)融合,从而获得原核表达质粒:pTWIN1/EchybF2.经转化大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG诱导下进行凝乳酶的表达.SDS-PAGE电泳分析和酶活性实验结果显示,CBD-intein-EchybF2融合蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在,并具有凝乳活性.     

红曲菌Mn-SOD基因克隆、表达及序列分析

为得到产Mn-SOD工程菌及表达产物,通过设计出红曲菌H4000 Mn-SOD简并引物得到目的基因片段,再设计全长引物利用PCR技术扩增红曲霉Mn-SOD基因的全长序列。经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后连接至相同酶切的表达载体pET28a,并转化至E.coli BL21进行诱导表达。克隆得到的基因预测编码152个氨基酸,预测相对分子量为17 kDa。同时,将克隆得到的Mn-SOD基因与NCBI数据库进行比对,发现该序列与橙色红曲霉超氧化物歧化酶(SOD)基因相似度达到99%,与炭疽菌、米曲霉、黄曲霉的Mn-SOD基因也有较高的相似度。通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,目标蛋白相对分子质量约为19 kDa,与预测分子量基本相符。该表达蛋白在pH2.0保温处理1 h,仍具有较高的Mn-SOD酶活。     

原核表达重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶酶学特性

凝乳酶能够专一性裂解κ-酪蛋白,是制造干酪的关键酶。运用大肠杆菌表达系统对牛凝乳酶原进行了原核表达和初步纯化,活化重组凝乳酶原及测定凝乳活性,对重组凝乳酶的酶学特性进行分析。结果表明:大肠杆菌表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的66.3%,每升培养液可纯化约200 mg的重组凝乳酶原,活化后的凝乳酶活力可达600 000 SU/g。经测定凝乳酶最适作用温度为57⁶2℃,并在pH 262℃,并在pH 2⁷、低于40℃的温度范围内稳定。金属离子中Al3+,Fe3+和Cu2+能显著增强酶活;胃蛋白酶抑制剂pepstatin A对酶有明显的抑制作用。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

干酪用牛凝乳酶替代品的研究进展

牛凝乳酶具有高凝乳活性和低非特异蛋白水解活性而广泛用于干酪制备。随着干酪市场的逐年增长,牛凝乳酶出现供不应求,其替代品应运而生,包括其他动物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶、重组凝乳酶。在这些替代品中,重组牛凝乳酶显示出与天然牛凝乳酶相似的酶学特性,并且纯度更高,制作的干酪品质更好。目前已经有重组牛凝乳酶上市出售,成功替代了天然牛凝乳酶,但关于提高重组牛凝乳酶表达量与催化活性的研究远未止步。文中主要综述了凝乳酶结构、牛凝乳酶的替代品和重组凝乳酶的研究进展,详细综述了一些提高重组牛凝乳酶的表达方法,为外源蛋白在宿主中的高水平表达提供了有效参考。     

原核表达重组牛凝乳酶的纯化

原核表达获得的重组牛凝乳酶与商品重组牛凝乳酶有相似的酶学特性,具商业潜力,故进一步研究其纯化方法。使用离心与饱和硫酸铵沉淀,成功纯化出有活性的重组牛凝乳酶。蛋白最终回收率为1.82%,总活力比纯化前提高了73.3%,比活力提高了95.3倍。同时,讨论了如何提高包涵体复性率与产物回收率,为今后该酶的工业化生产提供技术参考。     

重组牛凝乳酶原与重组单峰驼凝乳酶原活化速率的初步比较

原核表达的重组牛凝乳酶原与重组单峰驼凝乳酶原,包涵体经溶解和复性后,酸化/中和处理获得成熟凝乳酶。酸化/中和处理两种酶原时发现二者的活化速率有明显差别。相同条件下,牛凝乳酶原在2h以内即可完全活化,而单峰驼凝乳酶原需3d以上。将牛凝乳酶propeptide序列部分或全部取代单峰驼凝乳酶原相应序列,并构建到相同原核表达载体进行表达与复性,获得的融合蛋白MUT-1和MUT-2经酸化/中和处理,MUT-1在p H 2.0~8.5范围均不能活化,MUT-2的活化情况与单峰驼凝乳酶原相同。这也暗示酶原的激活不仅涉及propeptide与酶活性部位的静电作用,还可能与凝乳酶的结构或酶活相关。     

枯草芽孢杆菌克隆与表达微小毛霉凝乳酶基因

从自制的酒酿利用酪蛋白培养基分离纯化到了一株产凝乳酶的微小毛霉菌株（ZZMZ-19）,从ZZM-19菌株的cDNA文库筛选到了两个凝乳酶基因chl和ch2并实现了凝乳酶基因ch1和ch2在枯草芽孢杆菌菌株（ZZMZ-01）中的的克隆与表达。chl和曲2阳性克隆菌株在酪蛋白培养基r1]发酵30h左右的时间凝乳酶酶活达到最人,分别为48．27SU／mL和41．02SU／mL,相比出发菌株发酵时间缩短了15h。用交联葡聚糖凝胶柱G100分离纯化其发酵卜清液后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测得CHII和cHIII分子草分别为32ku和30ku。     

XJT-9503高温中性蛋白酶基因Gp1的克隆、表达及序列分析

试验根据地衣芽孢杆菌XJT9503的高温中性蛋白酶酶蛋白所测定的N-端及部分肽段氨基酸序列及质谱分析结果设计了PCR引物,用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503中扩增了高温中性蛋白酶基因Gp1,对所获得的基因进行序列分析测定,并与蛋白酶的氨基酸序列分析对比。GP1基因全序列共1129bp,包括整个阅读框,共编码376个氨基酸。将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-28a中,构建成重组分泌型表达载体pGp1。并在大肠杆菌宿主BL21中得到表达。SDS-PAGE分析显示产物的分子量为27.0×103,同核酸序列测定所推导的值相符。同时,对地衣芽孢杆菌XJT9503中性蛋白酶基因序列进行了测定和比较分析,发现与地衣芽孢杆菌6816丝氨酸蛋白酶和地衣芽孢杆菌1411T角蛋白水解酶基因的同源性为97%。     

枯草芽孢杆菌QM11漆酶基因克隆表达及序列分析

为获得高效表达的产漆酶工程菌,将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的漆酶（cotA）基因在大肠杆菌中表达。用PCR的方法从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QM11基因组中扩增cotA基因,连接载体pET22b构建成表达载体pET22b-cotA,转化至E.coli BL21（DE3）进行诱导表达,最终通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。克隆得到的cotA基因含有1542个核苷酸,由513个氨基酸组成,预测相对分子量为58 ku,理论等电点为5.91,无信号肽,二级结构以β-折叠和无规卷曲为主,其中β-折叠占26.71%,无规卷曲占52.05%,与NCBI已公布的Bacillus subtilis漆酶cotA基因（Gen Bank:GQ184294.1）碱基序列有12个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有4个发生了改变。通过SDS-PAGE检测,目标蛋白相对分子质量约为54 ku,与预测相对分子量基本相符。      

苦荞麦主要过敏蛋白N端基因片段的克隆及序列分析

为了获得苦荞麦主要过敏蛋白全长基因并深入开展苦荞过敏蛋白的研究,本实验在先前获得的苦荞麦主要过敏蛋白C端(TBa)基因序列的基础上,设计不同的引物,以开花20d左右的苦荞麦果实为材料提取总RNA,并以此RNA为模板,通过RT-PCR和5’-RACE等方法,扩增,克隆获得苦荞麦主要过敏蛋白N端(命名为TBb)cDNA序列。序列分析结果表明,该序列由1005bp组成,开放阅读框为960bp,可编码一个由320个氨基酸残基组成的功能蛋白。同源性分析显示,此核苷酸序列与甜荞麦过敏性贮藏蛋白及豆球类蛋白的同源性达到90%。由此核苷酸序列推导出的氨基酸序列与甜荞麦13S贮藏蛋白有84%的同源性,与甜荞麦主要过敏蛋白有76%的同源性。苦荞麦主要过敏蛋白N端基因的获得为该蛋白的重组表达及其生物学活性等研究建立了前期基础。     

多糖奈瑟球菌中淀粉蔗糖酶基因的克隆及表达载体的构建

根据不同类型的奈瑟氏球菌中的淀粉蔗糖酶（amylosucrase）基因的保守序列设计引物,通过TD—PCR扩增的方法克隆出多糖奈瑟球菌ATC043768基因组中编码淀粉蔗糖酶的基因Ams2,将其与pMD～18T载体连接,得到重组质粒T—Ams2。序列测定及生物信息学分析结果表明,Ams2基因由1911个碱基组成,编码6j7个氨基酸,Ares2与多糖奈瑟球菌ATCC85322菌株的同源性达g6％,对应的氨基酸同源性为97％。将该基因插入表达质粒pET-28a中,构建重组质粒pET28a～Ares2,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。     

甘蔗UGPase DNA及其5’侧翼序列的克隆与序列分析

以甘蔗（FN95-1702）为材料,首次克隆得到甘蔗UGPaseDNA片段,测序结果表明该基因全长约5-3kb,包含21个外显子,20个内含子。开放读码框（ORF）共编码476个氨基酸。通过接头连接PCR方法克隆得到约0．8kb的该基因5’侧翼序列,并对得到的序列进行基础启动子区及调控元件分析,预测在该序列上存在TAT...     

烟草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析

采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以烟草品种K326叶片总RNA为模板扩增出烟草法呢基焦磷酸合酶基因fps,克隆至载体PMD19-T中。序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长702 bp,共编码234个氨基酸残基,其核酸序列与玉米、杜仲、拟南芥、青蒿、Nicotiana sanderae×Nicotiana langa-dorffii杂交种的法呢基焦磷酸合酶基因的核酸序列同源性分别为74%,76%,77%,80%和97%。     

新型卤代醇脱卤酶基因的克隆、序列分析及表达

卤代醇脱卤酶可以催化合成具有光学纯的环氧化物及β-取代醇等高价值手性药物中间体。作者所在实验室利用宏基因组技术从无锡新区工业集中地污染土壤中筛选了一段编码基因Y,经测序知其片段包含有765 bp的核苷酸,编码254个氨基酸。经Blast软件分析,其氨基酸序列与来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的卤代醇脱卤酶Hhe C同源性为81%,且含有卤代醇脱卤酶类的保守催化三联体Ser132-Thr145-Arg149。推测其属于卤代醇脱卤酶Hhe C类,命名为Sy Hhe C。根据大肠杆菌Escherichia coli BL21的密码子偏爱性,对基因Y进行密码子优化和人工合成,命名为Syhhe C,构建重组表达质粒p ET28a-Syhhe C,转化感受态E.coli BL21,表达产物经镍柱亲和层析后获得电泳纯的重组卤代醇脱卤酶re Sy Hhe C。SDS-PAGE分析,re Sy Hhe C的相对分子质量为34 000。以2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇为底物,re Sy Hhe C催化底物产生2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的比活性为5.2 U/mg。     

南方红豆杉GGPP合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据GeneBank中公布的GGPPS基因保守区设计特异引物,克隆南方红豆杉GGPPS基因的DNA和cDNA序列,并通过生物信息学方法对其核苷酸序列和蛋白质结构进行分析预测。结果表明,GGPPS基因DNA和cDNA序列都为1 182 bp,DNA序列中无内含子,cDNA序列为一个编码393个氨基酸残基的开放式阅读框;GGPPS的理论相对分子质量为42 590,等电点为5.68。核苷酸同源性分析显示,它与Taxus canadensis(AF081514)同源性为98.8%;推导出的氨基酸序列与Taxus canadensis(AAD16018)同源性达99.0%。利用Protparam、SignalP、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling、Scan Prosite和MEGA4.0等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构、三级结构和进化树进行分析,为其功能研究和生物合成紫杉醇研究提供分子基础。     

天然无咖啡碱茶叶N-甲基转移酶基因克隆与序列分析

本研究以天然无咖啡碱南昆山毛叶茶为主要研究材料,以不同咖啡碱含量的英红9号茶树品种和红山茶等山茶属植物为对照,采用RT-PCR技术,克隆获得南昆山毛叶茶、英红9号和福云6号茶树品种的NMT基因全长,分别编码365、369和369个氨基酸。序列比较分析表明南昆山毛叶茶NMT基因与其它茶树NMT基因的核苷酸序列同源性高于86.5%,氨基酸序列同源性高于86.3%,并包含了六个保守序列、三个SAM结合区A、B’、C及一个保守域VFFF。基于同源性比较,推测核苷酸序列的差异可能是导致南昆山毛叶茶NMT基因活性改变、影响茶树体内咖啡碱代谢的原因之一。     

青钱柳鲨烯合成酶(CpSS)全长基因的克隆、分析与表达

为研究和调控青钱柳三萜代谢,克隆了青钱柳鲨烯合成酶(CpSS)全长基因,研究该基因的特征和蛋白结构,以及青钱柳悬浮培养细胞在黑曲霉诱导子作用下该基因的表达变化情况。本文以青钱柳悬浮细胞RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出全长为1 667 bp的CpSS基因cDNA序列,该序列包含一个1 245 bp的完整ORF,编码414个氨基酸;CpSS序列与胡桃鲨烯合成酶基因的相似度最高,相似度达到97%,与白桦、葡萄、大豆、甘草、可可5个物种的相似度都在85%以上。序列分析表明,CpSS蛋白属于不稳定亲水蛋白,具有典型的鲨烯合成酶保守区和结构域,存在于内质网膜中,由多个α螺旋组成空穴状结构,该结构与大多数植物鲨烯合成酶蛋白的空间结构相似。实时荧光半定量RT-PCR检测结果表明,在黑曲霉诱导子作用下,悬浮培养细胞CpSS基因表达量显著增加,在诱导后60 h时的表达量最高。本文可为深入研究青钱柳三萜代谢途径及真菌诱导子的诱导作用机制提供参考。