水稻白叶枯病菌受寄主诱导基因的鉴定

用一个具链霉素（Ｓｍ）抗性并含无启动子ＣＡＴ基因的广宿主启动子探针质粒ＰＩＪ３１００，用鸟枪法在ＣＡＴ基因上游的ＢａｍＨ１克隆位，或插入水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ），用ＢａｍＨ１完全酶切的染色体ＤＮＡ片段，将重组质粒转化大肠杆菌ＥＤ８７６７在含链霉素的ＬＢ单板上筛选转化子。得到容量为６０００个转化子的克隆群体，其中２％的克隆含有水稻白叶枯病菌启动子活性片段，在平板上表现氯霉素（Ｃｍ）抗性。在帮助质粒ＰＲＫ２０１３的帮助下，通过三亲支配，将含有水稻白叶枯病菌启动子片段的重组质粒转移进野生型的水稻白叶枯病菌中去，在含链霉素的ＰＳＡ平板上筛选１６００个接合子，其中一个在平板上表现氯霉素抗性及含有组成表达的水稻白叶枯病菌启动子。随机选取２００个平板上对氯霉素敏感的接合子，接种用氯霉素处理的水稻感病品种金南风，得到１５个比对照明显致病的克隆。用其中一个含受水稻特异诱导启动子的重组质粒为探针，在水稻白叶枯病菌野生菌基因文库中筛选到２７个阳性克隆。     

水稻白叶枯病菌无毒基因的研究初报

报道了用基因标签法克隆水稻白叶枯病菌无毒基因的研究过程。通过接合实验，将Ｔｎ５引入水稻白叶枯病菌日本系统５号小种中去，在ＬＢ＋Ｋｍ平板上筛选了２５００个接合子；用剪叶接种法，将接合子接种水稻品种ＩＲ２６，得到了４个无毒基因突变体，分别用粘粒载体ｐＳａ７４７和质粒载体ｐＵＣ１９构建了ＪＸＯＶ核基因文库和无毒基因探针，采用菌落原位杂交法在基因库中钓取了１３个无毒基因克隆。该无毒基因片断在此病原的不同小     

转抗菌肽B基因水稻植株的获得与鉴定

构建了一个适合在水稻中表达含有抗菌肽Ｂ基因的转化载体，应用基因枪转化法将其导入水稻未成熟胚，获得了一些转基因水稻植株。根据对选择标记基因和目的基因的分子检测和抗病性测定，证明抗菌肽Ｂ基因已整合入转化水稻基因组并在转基因水稻中表达了抗病性。     

基因枪法转化水稻(Oryza sativa L.)获得可育的转抗虫基因水稻再生植株

应用基因枪（particle bombardment)转化技术成功地将豇豆胰蛋白酶抑制剂（cowpea trypsin inhibitor,CpTI)基因分别导入三个水稻粳稻栽培品种（Oryza sativa L.,japonica)中花8、中花10和中作321的幼胚和胚性愈伤组织中,并由此获得了可育的再生植株,抗性植株的筛选频率为6．1％－12．24％。经PCR、Southern blot分子检测和ELISA检测等证实所获得的潮霉素抗体植株为转基因植株。抗虫性分析结果表明,部分转基因水稻植株对玉米螟虫（Ostrinia nubilalis)有较好的抗性。     

略论水稻生殖发育基因研究的相关应用目标

从水稻遗传育种学角度探讨了研究水稻生殖发育基因的重大意义,提出了水稻生殖发育基因研究的６个相关应用目标。     

水稻细菌性条斑病抗性基因定位

以高感和高抗细菌性条斑病（细条病）的两个籼稻品种Ｈ３５９和Ａｃｃ８５５８为亲本，建立了一个重且自交系群体。利用该群体构建了一张包含２２５个分子标记的连锁图。１９９６年和１９９７连续两年对该群体进行了细条病抗性鉴定。采用ｔ测验法、复合区间定位法及多性状复合区间定位法对细条病抗性基因（ＱＴＬ）进行了定位分析。共检测出１１个ＱＴＬ，分别位位于第１、２、３、４、５、７、８和１１号染色体上，效应大小彼此接近     

表达harpin基因的大肠杆菌DH5（pCPP430）诱导植物抗病性的研究

用表达ｈａｒｐｉｎ基因的大肠杆菌ＤＨ５进行了诱导植物抗病性的研究，发现表达ｈａｒｐｉｎ基因的重组菌除可明显诱发烟草、番茄叶片的过敏反应外，对玉米、水稻叶片也可诱发过敏反应，反应比相应阳性对照病菌速度快，坏死斑也更典型。用ＤＨ５菌悬液喷雾或注射诱导后，番茄对早疫病、水稻对稻瘟病、玉米对大、小斑病、马铃薯对软腐病的抗性均有不同程度的提高，与水杨酸诱导的抗性效果相当或比其略高。     

天花粉蛋白基因在水稻中转化及抗虫研究

利用基因枪转化法将天花粉蛋白基因导入水稻。经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈ－ｅｒｎ杂交分分析证明外源基因已整合到水稻基因组中并有转录。抗虫试验表明,与对照比较转基因水稻明显地增强了对螟虫、稻飞虱的抗性。     

水稻小GTP蛋白基因Osrab5B基因的克隆和鉴定

用已知遗传图位的BAC克隆片段,对水稻（Oryza sativa)小穗cDNA文库进行筛选,获得一个水稻小GTP结合蛋白（small GTP-binding protein,SGP)的相关序列,序列测定后以该cDNA序列为基础将４个表达序列标记（EST）进行了电子克隆（electronic cloning),根据电子克隆结果设计引物,利用RT－PCR方法获得了一个水稻（Oryza stiva)中尚未鉴定的cDNA克隆Osrab5B,长1016bp。它与龙船海棠属（Mesembryanthemum crystallinum)和百脉根属（Lotus japonicus)命名为rab5B基因（序列登录号分别是AJ006225和Z73939）有着高度同源性（cDNA核苷酸序列ID值分别大于74％和76％）,同属rab家族的一个新的亚族。进而根据Osrab5B的cDNA序列设计引物,扩增得到Osrab5B的基因组克隆,序列分析表明它至少有7个内含子和8个外显子。     

快速cDNA文库筛选和淀粉合成酶基因的分离与鉴定

建立了一种以PCR为基础的快速筛选cDNA文库的方法。该方法利用96孔板和一对特异的引物,逐级从cDNA文加筛选目标克隆,最终获得目标DNA片段。与同位素杂交筛选方法相比,该方法具有快速、简单、省时等优点,数日内即完成目标片段的克隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳隆;同时,还可极大地降低实验费用,且无需使用同位素。本文利用这一方法从水稻南粳37未成熟种子的cDNA文加筛选出了完整的水稻可溶性淀偻合酶基因cDNA序列。我们认为此方法对于筛选其他类型文库同样有借鉴意义。     

水稻光(温)敏核不育基因的定位分离、研究进展及对策

本文从经典遗传学的角度分析了水稻光（温）敏核不育性，认为在定位、分离光（温）核不育基因时，应尽可能选择受１对基因控制的不育系及其分离群体。对标记基因法、同工酶标记法和ＤＮＡ标记法进行光（温）核不育基因染色体定位的优缺点及其定位结果不一致的原因进行了探讨。比较了各种植物基因克隆技术在分离光（温）核不育基因上的优缺点，认为图谱分离法虽已有一定的基础，但要在距不育基因１ｃＭ范围内找到分子标记并克隆出此基     

Tid基因对水稻的转化及转基因植株的抗虫性

利用基因枪转化法将大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)基因Ti^d转入北方推广的水稻(Oryza sativa L)品种丰优301和通887，所获得的潮霉素抗性植株通过GUS组织化学分析、PCR检测、Southern blot分子检测，证实Ti^d基因已经转入水稻基因组中，为转基因植株。用转基因水稻植株叶片进行了室内饲喂水稻二化螟(Chilo suppressalis)实验，抗虫性分析结果表明，与对照比较，部分转基因水稻植株明显地增强了对水稻二化螟虫的抗性。对转基因R1代植株进行PCR和PCR Southern分析，表明外源基因在转基因植株后代今稳定遗传。     

Wx基因失活时淀粉合成相关基因对稻米蒸煮和食味品质的影响

用相关基因位点的分子标记检测'扬辐糯4号'(籼糯)/'苏御糯' (粳糯)的F2群体共501个单株,结果表明,在wx基因失活的情况下GC变异与所研究的淀粉合成相关基因无关,而SssⅡa基因仍能解释GT变异的25.1%.除所研究的主要淀粉合成相关基因外,可能还存在其他遗传因素控制GC/GT的变异.     

转PSAG12-ipt基因水稻植株的获得及其延衰性的初步研究

运用农杆菌转化法将叶片衰老抑制基因PSAG12-ipt转入南方推广的优质籼型不育系中A、恢复系明恢63、南胜10号,所获得的潮霉素抗性植株通过GUS组织化学分析、PCR检测、Southern blot分子检测证实,PSAG12-ipt已经转入水稻基因组中.对转基因植株进行了延衰性考察,结果表明,与对照组相比,部分转基因水稻植株明显表现出叶片推迟衰老,提高了单株有效穗数、千粒重.对转基因R1代植株进行了PCR和PCR Southern分析,表明外源基因在转基因植株后代中稳定遗传.     

蓝藻热休克诱导高效表达系统的构建

以聚球藻Synechococcus sp.PCC7942作为基因工程受体菌，构建了热休克诱导的高效表达系统。用PCR法扩增并克隆出Synechococcus sp.PCC7942自身的热休克基因groESL操纵子的强启动区（240bp），并紧靠其后组装上泛素（UB）融合的胸腺素α1（Tα1）目的基因，在下游组装的rbcSpolyA终止子。此外，还组装了一个完整的卡那霉素抗性基因作为筛选标记基因。这样，就构建了完整的蓝藻的基因表达系统。经转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942细胞，在42℃热诱导30min后，目的基因UB－Tα1得到较高水平表达，表达量约占可溶性蛋白的8．7％。     

SYBR Green I实时PCR检测转Cry1Ab/c基因水稻

为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green I实时PcR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/e).结果表明,利用SYBR Green I染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因抗虫水稻外源基因(CaMV35S,NOS,CrylAb/c)扩增所产生的荧光信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体.SYBR Green I实时PCR技术是转基因成分检测的一种新方法.     

TUB2基因重组质粒的构建、鉴定及其在毛壳菌中的转化

根据苯并咪唑类杀菌剂抗性基因的核酸序列 ,在其阅读框架外的上、下游设计一对特异性引物 ,并在其 5′ 端分别加上PstI位点。以pRB12 9质粒为模板 ,PCR扩增得到一条长约 1 4kb的片段 ,经酶切鉴定证明是TUB2基因。将此PCR产物经消化后与同样酶切的pTA质粒连接 ,构建出 pTA TUB2质粒并转化大肠杆菌。再以pTA TUB2质粒为模板 ,PCR扩增该目的基因 ,通过对其核苷酸序列分析证明构建的质粒是含TUB2基因的 pTA TUB2质粒。利用PEG方法 ,将该质粒转化毛壳菌 ,使得对多菌灵非常敏感的毛壳菌能够在 30 0 μg/ml多菌灵的培养基上正常生长 ,其抗药性提高 30 0倍以上 ,且转化稳定性试验表明 ,其抗药性在非选择性培养基上连续培养 10代保持不变。结果表明质粒pTA TUB2对毛壳菌的转化率为 2 7/ (2× 10 5)。     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白基因片段原核载体的构建及表达

淋巴囊肿病病毒感染牙鲆鳃细胞系FG-9307，提取细胞总RNA，采用RT-PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白0．6kb基因片段。构建其原核表达载体，IPTG诱导表达。结果表明，该融合蛋白分子量约48kD，可与抗LCDV多克隆血清特异反应。为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础。     

转基因水稻基体标准物质候选物真实性的鉴定技术研究

PCR技术及琼脂糖凝胶电泳技术为基础,对转基因水稻克螟稻2号和阴性受体秀水11进行真实性 鉴定。利用典型性检测、指纹图谱技术对候选物的转基因事件的真实性、转入事件正确性(是否为特异性目标外源 基因）、品系遗传背景进行鉴定,结果表明,克螟稻2号只含特异性序列CrylAb,秀水11不含所选的外源基因,它们具有相同的遗传背景。随机各抽取克螟稻2号和秀水11水稻100株,通过特异性PCR、免疫印迹实验来检测原材 料的纯度,结果表明,克螟稻2号为100%的转基因水稻,秀水11为100%的阴性受体水稻。