小鼠B淋巴细胞活化刺激因子可溶性片段在毕赤酵母中的表达、纯化及其生物学活性的初步鉴定

目的在毕赤酵母中表达小鼠B淋巴细胞活化刺激因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)可溶性片段(msBAFF),纯化后检测其生物学活性。方法采用RT-PCR法从BALB/c小鼠外周血单核细胞中扩增msBAFF基因,插入表达载体pPICZαA中,构建重组表达质粒pPICZαA-msBAFF,转化巴斯德毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达的重组msBAFF蛋白经硫酸铵沉淀及Q Sepharose XL阴离子交换柱纯化后,分别单独及与anti-IgM共同作用于BALB/c小鼠脾脏B淋巴细胞,检测其对B淋巴细胞活力的影响。结果重组表达质粒pPICZαA-msBAFF经双酶切鉴定构建正确;表达的重组msBAFF蛋白相对分子质量约为20 000,诱导60 h表达量较高;经硫酸铵沉淀、透析除盐及Q Sepharose XL阴离子交换柱纯化,获得了较纯的msBAFF,BCA法测定纯化蛋白的产率为20 mg/L;重组BAFF蛋白具有促进小鼠B淋巴细胞活力的作用。结论成功在毕赤酵母中表达了重组msBAFF蛋白,纯化的重组蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究小鼠BAFF基因的功能及基于BAFF的佐剂与单克隆抗体的制备奠定了物质基础。     

核心链霉亲和素在毕赤酵母中的表达及纯化

目的构建核心链霉亲和素(core-streptavidin,CSA)酵母表达载体,表达、纯化CSA蛋白,并测定其活性。方法通过基因操作获得天然SA的核心活性区域基因片段,克隆至酵母表达载体p PIC9K,重组表达质粒p PIC9K-CSA经电击转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中,甲醇诱导表达CSA蛋白。利用硫酸铵沉淀、2-亚氨基生物素琼脂糖凝胶亲和层析法纯化CSA蛋白,紫外光谱测定法检测CSA蛋白与生物素的结合活性。结果构建的CSA基因工程菌能有效表达目的蛋白,经硫酸铵沉淀、亲和层析两步法纯化后得到纯度约95%的CSA重组蛋白,其具有与生物素结合的活性,活性为13.6 U/mg。结论利用毕赤酵母表达系统能够有效分泌表达CSA蛋白,该重组蛋白具有良好的生物学活性,为CSA发酵产品的大规模纯化提供了依据。     

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的在毕赤酵母中表达并纯化人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)辅助调节蛋白Vpu。方法从质粒p CDNA3.1-vphu中PCR扩增vphu基因,插入毕赤酵母表达载体p PICZαA,构建重组表达质粒p PICZαA-vphu,转化巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达带有6×His标签的重组Vpu蛋白。表达产物经Ni-Agarose 6×His标签纯化柱纯化。表达和纯化产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-vphu经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约16 000,主要存在于细胞内;纯化后杂蛋白减少,与抗VPU抗体和抗His标签抗体均可结合,浓度为224μg/ml。结论利用毕赤酵母表达系统成功表达并纯化了HIV-1 Vpu蛋白,纯化的蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究其结构和功能以及靶点药物筛选模型的建立奠定了基础。     

人胰岛素前体在毕赤酵母中的组成型表达及其活性

目的通过毕赤酵母GAP启动子高效分泌表达人胰岛素前体,并检测重组胰岛素类似物的生物活性。方法经密码子优化并人工合成人胰岛素前体基因IS基因,插入pGAPZaA组成型表达载体中,构建重组表达质粒pGAPZaIS,电转化至感受态毕赤酵母SM1168菌株中,PCR鉴定阳性重组子;高抗性YPD平板筛选高蛋白表达株并优化表达条件;表达产物经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析;用吸附树脂吸附、阳离子交换层析、超滤纯化后,用经TPCK处理的胰蛋白酶切除人工C肽,经阴离子交换层析和醋酸锌沉淀纯化后,进行Tricine-SDS-PAGE分析;将12只链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)致糖尿病模型的小鼠随机分为A组和B组,A组小鼠经腹腔注射含1.8%甘油的注射用水作为对照组,B组小鼠经腹腔注射用胰岛素类似物配制的0.05 mg/ml注射用水剂(含1.8%甘油),10μl/g,空腹6 h后,断尾取血,用血糖仪检测小鼠血糖值。结果重组表达质粒pGAPZa-IS经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;共获得5株高抗性重组菌,其表达产物均可见相对分子质量约6 000的目的蛋白条带,与小鼠抗胰岛素单克隆抗体不发生特异性反应,5号菌72 h表达量最高;C肽切除后,获得了纯胰岛素类似物;模型小鼠在注射胰岛素类似物6 h后,血糖值均明显降低,B组小鼠注射前后血糖值及A、B组间的血糖值差异均有统计学意义(P<0.01)。结论在毕赤酵母中,利用GAP启动子成功高效表达了胰岛素前体,并具有良好的降血糖活性。     

一种新型杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

目的在毕赤酵母中表达杂合抗菌肽CA(1-11)CD(12-37)ME(1-18)(ADM),并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母(Pichia pastoris)偏爱密码子,合成杂合抗菌肽CA(1-11)CD(12-37)ME(1-18)基因,插入pPIC9K载体,构建重组表达质粒pPIC9K-ADM,电转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性菌株,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE检测ADM蛋白的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果重组表达质粒pPIC9K-ADM经双酶切和测序鉴定证明构建正确;阳性酵母转化子的PCR产物可见目的基因条带;杂合抗菌肽在毕赤酵母GS115中获得分泌表达,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;且对E.coli DH5α、E.coliJM109和金黄葡萄球菌具有一定的抗菌活性。结论已在毕赤酵母GS115中表达了具有一定抗菌活性的杂合抗菌肽ADM,为相关新药的研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在毕赤酵母中的表达及其病毒样颗粒的免疫原性

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒18型(Human papilomavirus 18,HPV18)L1蛋白,纯化病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),并检测其免疫原性。方法将含HPV18 L1基因的酵母表达质粒pHPV18 L1电转化毕赤酵母X-33,甲醇诱导表达,重组HPV18 L1蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经离子交换层析、分子筛层析纯化,采用SEC-HPLC分析纯度;动态光散射和透射电镜分析粒径分布和结构;并通过小鼠半数有效剂量(ED50)和大鼠抗体滴度测定分析其免疫原性。结果 HPV18 L1蛋白在毕赤酵母中获得了有效表达,相对分子质量约为55 000,可与小鼠抗HPV18 L1单抗特异性结合;经纯化的HPV18 L1 VLPs纯度为99%,且颗粒大小均一,直径约50 nm;经吸附铝佐剂后,免疫小鼠的ED50为0.006 68μg;并可诱导大鼠产生较高的抗体滴度。结论 HPV18 L1可在毕赤酵母中高效表达并自动形成VLPs,该VLPs经纯化、吸附铝佐剂后具有良好的免疫原性,为工业化生产HPV18 L1疫苗奠定了基础。     

人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性

目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。     

人松弛素H2类似物在毕赤酵母中的高效表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达人松弛素H2类似物(Human relaxin-2 analogue,HR2),并检测其生物活性。方法通过密码子优化合成HR2基因,构建重组表达质粒pPICZαA-HR2,转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。表达产物经超滤和柱层析纯化后,切除人工C肽,检测其生物活性。结果经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pPICZαA-HR2构建正确;Tricine-SDS-PAGE分析显示,表达的重组蛋白相对分子质量约6 500,表达量占菌体总蛋白的47.6%,为451μg/ml,且为分泌表达;Western blot分析显示,重组蛋白具有良好的反应原性;纯化的重组蛋白纯度达96%;经检测C肽切除的重组HR2对THP-1细胞具有刺激活性。结论成功在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了重组松弛素H2类似物,并具有一定的生物活性。     

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响

目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。     

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。     

白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建白细胞介素-10(IL-10)基因多拷贝表达盒,提高IL-10在毕赤酵母中的表达水平。方法体外构建重组表达载体αIL-10/pAO815,BamHⅠ和BglⅡ双酶切获得目的基因表达盒(AOX-αIL-10),再连接到BglⅡ酶切位点处,依次构建多拷贝重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815。从质粒pPIC9K上用NdeⅠ和SalⅠ双酶切获得Kan抗性基因,重组到多拷贝表达载体n(AOX-αIL-10)/pAO815上。重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815电转化毕赤酵母,PCR筛选含有IL-10基因的酵母转化子,甲醇诱导表达,对表达量高的转化子再次经重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan电转化,高浓度G418抗性筛选二次酵母转化子,使用甲醇诱导表达。ELISA测定IL-10含量,MC/9细胞测定IL-10活性。结果所构建的8拷贝表达盒的重组载体8(AOX-αIL-10)/pAO815和4拷贝表达盒4(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan,转化子分泌表达IL-10水平最高,为(8.25±1.65)mg/L,比活性为1.465×105U/mg。结论已成功构建了高拷贝表达盒,并提高了IL-10在毕赤酵母中的表达水平。     

单启动子双拷贝CPC酰化酶基因在毕赤酵母中的表达

为了实现外源基因在毕赤酵母中的高效表达,以口蹄疫病毒的2A片段连接2个头孢菌素C (CPC)酰化酶基因,形成双顺反子结构的质粒,整合到毕赤酵母的基因组中,并以筛选标记和聚合酶链式反应进行验证,最终得到双拷贝的阳性重组子. 通过摇瓶发酵培养,双拷贝转化菌株的最高酶活为2810 U/L,而在相同菌体浓度下,双拷贝转化菌株的CPC酰化酶酶活为单拷贝转化菌株的1.6倍. 利用结构短小和高剪切效率的2A多肽,不但可达到单启动子调控多份基因的目标,也为真核表达系统中以基因的拷贝数增强外源蛋白的表达提供了简便且高效的思路.     

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

HBsAg/GM-CSF融合蛋白的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达HBsAg/GM-CSF融合蛋白。方法利用PCR扩增HBsAg和GM-CSF基因,通过15个氨基酸的连接肽将两个片段连接,获得融合基因S-GM,克隆入酵母穿梭质粒pPIC9K中。将重组质粒9K-S-GM电转化毕赤酵母后,G418筛选,甲醇诱导,HBsAg/GM-CSF融合蛋白表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测表达产物特异性。结果PCR扩增的片段与预期大小一致,HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达。Western blot检测,该融合蛋白同时具有HBsAg和GM-CSF的特异性。结论该融合蛋白的获得为提高乙肝疫苗的免疫原性奠定了科学基础。     

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。