克雷伯氏菌产β-半乳糖苷酶的异源表达及低聚半乳糖合成工艺优化

β-半乳糖苷酶是低聚半乳糖制备过程中的关键酶。本文克隆生菌株克雷伯氏菌B5582Y的β-半乳糖苷酶基因lacZ,并成功构建大肠杆菌重组质粒pET28a-24。经IPTG诱导表达其酶活力比野生菌株提升近10倍。通过单因素及响应面法考察重组酶对低聚半乳糖合成的影响,得到最佳工艺条件为:加酶量130 U/mL,温度44℃,底物添加量90%,pH 7.0～7.5,反应时间10 h,低聚半乳糖的产率达44%。重组酶表现出较好的转糖苷活性,在低聚半乳糖合成领域具有较大的应用潜力。     

奶酪中高产β-半乳糖苷酶菌株的筛选及发酵条件的优化

以新疆哈萨克族奶酪样品为原料,通过蓝白斑筛选找到9株产β-半乳糖苷酶的菌株.经过摇瓶发酵测定β-半乳糖苷酶的水解活性,筛选出一株酶活力较高的菌株y-2,经鉴定为马克斯克鲁维酵母.通过研究温度、pH、破壁时间、乳糖浓度、金属离子和接种量6个参数对这株菌酶活的影响,以优化合成培养基中β-半乳糖苷酶的产生.通过单因素试验进行...     

基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究

探究了磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶对乳酸乳球菌乳糖代谢的影响。通过对12株乳酸菌在以乳糖为单一碳源环境下的生长、产酸、乳糖代谢情况、β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力及发酵液中残留半乳糖含量进行测定,了解不同菌株乳糖代谢的差异。结果表明,不同的乳酸乳球菌乳糖代谢能力存在显著性差异;β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为270～4 110 mg/L,而磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为40～900 mg/L;将磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配,发酵液中半乳糖含量较嗜热链球菌单菌发酵时显著降低。磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌有助于降低发酵乳制品中的半乳糖含量。     

传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件

分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌新菌株,为酶法高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新的酶源。以乳糖为唯一碳源,碳酸钙溶钙圈和添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基筛选平板进行初筛,以产酶菌株粗酶液催化乳糖反应产物的薄层色谱（thin layer chromatography,TLC）分析复筛,从新疆伊犁地区牧民手工制作的奶酪样品中筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌。结合其形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析对产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株进行鉴定。单因素试验确定产酶条件和转糖基反应条件,TLC结合高效液相色谱分析转糖基反应产物各组分含量。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株6 株,其中Lactobacillus plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶的转糖基活性最强。单因素试验结果表明,在温度50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL的条件下反应4 h,GOS得率可达质量分数43.40%,其中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%。以上结果表明,L. plantarum YLBGNL-S7是一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株,在益生性GOS的合成领域具有应用前景。     

产耐热β-半乳糖苷酶蜜源芽孢杆菌的鉴定及酶学性质

从分离自蜂蜜的芽孢杆菌中筛选到一株高产β-半乳糖苷酶的菌株,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),并命名为Bacillus licheniformis SYBC hb15。纯化该酶并研究其酶学性质,以邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,B. licheniformis SYBC hb15所产β-半乳糖苷酶的最适水解反应温度是60℃;70℃放置60 min后酶活力仍保留65%,具有较高的热稳定性;与嗜热菌Talaromyces thermophilus来源的β-半乳糖苷酶相比,葡萄糖对其水解活性的抑制较弱。因此,B. licheniformis SYBC hb15所产的β-半乳糖苷酶具有较高的热稳定性和葡萄糖耐受性,有很好的工业应用潜力。     

驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及酶法合成低聚半乳糖的GC-MS分析

从分离自13种中国传统发酵食品的148株乳酸菌中筛选产高转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株。实验采用X-Gal平板初筛、薄层层析(TLC)复筛、气相色谱(GC)定量的方法,得到一株产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高的菌株,并以乳糖为单底物,利用该高转糖基活性β-半乳糖苷酶酶法合成低聚半乳糖(GOS),并采用GC-MS的方法对其各个组分进行鉴定。研究结果表明,菌株70810所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,其合成GOS产率达到39.23%(m/m);该菌株为实验室已鉴定乳酸菌,为植物乳杆菌(HQ259238)(Lactobacillus plantarum);酶法合成的GOS产物鉴定为9种低聚二糖和3种低聚三糖,主要结构多为β(1→6)和β(1→3)糖苷键。菌株70810来源于泡菜,安全性好,所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,且可不经纯化直接利用,在食品与乳品加工等方面将具有很好的应用前景。     

海洋低温β-半乳糖苷酶菌株筛选、鉴定及酶的分离纯化

筛选自黄海海泥产β-半乳糖苷酶的菌株CD6,依据形态学特征、生理生化特征及分子生物学特征鉴定为土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena)。通过透析、超滤和柱层析方法分离纯化菌株β-半乳糖苷酶,测定该酶的最适反应温度为20℃,30℃剩余相对酶活85%;超过35℃酶活力即迅速下降,确定其为低温酶。     

耐热乳酸菌的筛选及其β-半乳糖苷酶性质分析

本研究从鸡粪样品中分离高产β-半乳糖苷酶的耐热乳酸菌,经16S r RNA序列鉴定,分离得到的6株菌株均为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）。初步分析分离菌株所产β-半乳糖苷酶,其最适p H均为6.5。热稳定性实验发现,菌株MF1567产生的β-半乳糖苷酶在55℃温育1 h,仍保持51.2%的酶活力。分析菌株MF1567的β-半乳糖苷酶氨基酸序列和蛋白质结构,发现该菌株中β-半乳糖苷酶Lac Z存在22个氨基酸替代,其二级结构α-螺旋的比例较高（26.5%）。结果显示,蛋白质一级和二级结构的改变可能是该酶具有较好耐热性的原因。      

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的克隆及其作为食品级筛选标记的研究

为研究嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)作为食品级筛选标记的活性及筛选稳定性,作者从嗜酸乳杆菌基因组中克隆β-半乳糖苷酶基因并在乳酸乳球菌中表达,通过X-gal显色筛选阳性克隆;用X-gal显色筛选方法将重组乳酸乳球菌传60代,并测定β-半乳糖苷酶酶活和比活力。结果显示:通过表达有活性的β-半乳糖苷酶和X-gal显色可成功筛选出阳性克隆菌株;对借助X-gal传60代后的重组乳酸乳球菌进行β-半乳糖苷酶比活力检测,与X-gal筛选的第二代相比没有显著差异(P=0.5920.05),与红霉素筛选比较也没有显著差异(P=0.8820.05)。由此可见,β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记具有较好的活性和稳定性,为以β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记的食品级载体的研究奠定了基础。     

一种来源于青霉的β-半乳糖苷酶酶学性质研究

从土壤里筛选到20株产β-半乳糖苷酶的菌株,其中β-半乳糖苷酶活力最高的是菌株L7,通过形态学观察和18SrDNA序列分析,得出该菌株为斜卧青霉;并研究了其β-半乳糖苷酶的酶学性质。结果表明:β-半乳糖苷酶最适作用温度为60℃,最适pH为6.0,在60℃以下和pH3.0 7.0有较高的稳定性;Mg2+、Mn2+对β-半乳糖苷酶活性有显著的激活作用,Cu2+、Fe2+、和Zn+对酶活有较强的抑制作用;以ONPG为底物采用双倒数做图法测得Km为6.25mmol/L;经过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,该酶蛋白的分子量约为110kDa。     

Sulfolobus solfataricus P2 β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的表达及固定化

研究室获得1株来源于Sulfolobus solfataricus P2的β-半乳糖苷酶突变体F441Y,该突变体具有转苷性高,热稳定性好的特点。研究中,成功将β-半乳糖苷酶突变体F441Y在枯草芽孢杆菌中进行重组表达,3 L发酵罐发酵80 h后胞内酶活达到76.5 U/m L。鉴于β-半乳糖苷酶为胞内表达,为提高酶的使用效率并降低酶的成本,以2%的海藻酸钠、1%的明胶混合作为固定化包埋载体,2%氯化钙为固化液,0.5%的戊二醛为交联剂对重组菌进行细胞的固定化,全细胞酶活回收率达到62%,将该固定化细胞进行乳糖的酶转化,优化酶转化条件后,低聚半乳糖的最高转化率高达55.1%。     

产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

酶法合成乳果糖需要使用同时具备水解和转苷活力的β-半乳糖苷酶为催化剂。采用物理诱变,培养基优化手段,以提高细菌产该类β-半乳糖苷酶的能力为目的,自然筛选获得的具有转苷能力的节杆菌Arthrobacter sp.,经紫外线照射处理,采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为平板筛选显色剂,加之摇瓶发酵筛选,得到8株产酶水平明显提高的诱变株,其中Arthrobacter sp.M2酶活力较野生株提高了89%,传代5次酶活基本稳定。采用正交实验优化产酶培养基,结果表明:在乳糖浓度为10g/L,玉米浆浓度为22g/L,Fe3+浓度为1.5mmol/L时效果最佳,酶活水平进一步提高了113%。紫外诱变和培养基优化有效地提高了节杆菌产β-半乳糖苷酶的水平。     

产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

酶法合成乳果糖需要使用同时具备水解和转苷活力的β-半乳糖苷酶为催化剂。采用物理诱变,培养基优化手段,以提高细菌产该类β-半乳糖苷酶的能力为目的,自然筛选获得的具有转苷能力的节杆菌Arthrobacter sp.,经紫外线照射处理,采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）为平板筛选显色剂,加之摇瓶发酵筛选,得到8株产酶水平明显提高的诱变株,其中Arthrobacter sp.M2酶活力较野生株提高了89%,传代5次酶活基本稳定。采用正交实验优化产酶培养基,结果表明:在乳糖浓度为10g/L,玉米浆浓度为22g/L,Fe3+浓度为1.5mmol/L时效果最佳,酶活水平进一步提高了113%。紫外诱变和培养基优化有效地提高了节杆菌产β-半乳糖苷酶的水平。      

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

原生质体诱变选育高产α-半乳糖苷酶米曲霉菌株

介绍了以原生质体诱变技术选育高产α-半乳糖苷酶的米曲霉菌株,并研究了其发酵特性。以米曲霉FY-65为出发菌株,通过原生质体诱变,选育得到一株α-半乳糖苷酶活力较高的米曲霉突变株FY-UV15。该菌株具有良好的遗传稳定性,酶活力达到102 IU/g干曲,比出发菌株FY-65提高了25%。该研究为发酵生产α-半乳糖苷酶打下了良好的基础。     

微胶囊化的嗜酸乳杆菌在极端环境下的生理特性研究

研究了嗜酸乳杆菌NCFM菌株经胶囊化处理后对逆境的抵抗能力。结果表明,经pH值为2.5的酸处理后,微胶囊化菌株的活菌数(6.4×108 mL-1)、酸度(95oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.127 mmol/g.min),明显高于对照菌株(P<0.01)的活菌数(2.3×108 mL-1)、酸度(56 oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.078 mmol/g.min);经质量浓度为14 g/L的胃蛋白酶处理后,与对照菌株的活菌数(7.8×108 mL-1)、酸度(70 oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.01 mmol/g.min)相比,微胶囊化菌株的活菌数、酸度、!-半乳糖苷酶活力明显提高(P<0.01),分别为1.41×109 mL-1,119 oT和0.075 mmol/g.min;经质量分数为0.4%胆盐处理后,微胶囊化菌株的活菌数(4.8×108 mL-1)、酸度(98 oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.97 mmol/g.min),明显高于对照菌株(P<0.01)的活菌数(2.9×108 mL-1)、酸度(52 oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.43 mmol/g.min);经质量浓度为3 g/L胰蛋白酶处理后,与对照菌株的活菌数(0.2×107 mL-1)、酸度(48 oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.017 mmol/g.min)相比,微胶囊化菌株的活菌数、酸度、!-半乳糖苷酶活力显著提高(P<0.01),分别为3.5×108 mL-1,90.8 oT和0.1 mmol/g.min;经质量分数为18%的NaCl溶液处理后,微胶囊化菌株的活菌数(11.7×108 mL-1)、酸度(102 oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.52 mmol/g.min),明显高于对照菌株(P<0.01)的活菌数(0.37×108 mL-1)、酸度(38 oT)和!-半乳糖苷酶活力(0.18 mmol/g.min)。显然,微胶囊化处理能明显提高嗜酸乳杆菌在极端环境下的存活能力。     

乳糖酶生产酵母菌菌株的研究

从土壤和鲜牛奶中采用X—gal定性试验和ONPG定量试验对酶活性进行测定以筛选高产乳糖酶（β-半乳糖苷酶）的菌株。结果有21株在含有X—gal的琼脂培养基上产生蓝色菌落,5株ONPG酶活较高,其中酵母菌Y6号菌株酶活最高,酵母菌Y6号菌株在发酵培养20～24h生长量和产酶量均达到最大。     

微泡菌ALW1重组β-半乳糖苷酶的异源表达和酶学性质

β-半乳糖苷酶催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,是乳制品加工中重要的酶。该研究将微泡菌ALW1菌株的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达和纯化,研究其酶学性质。结果表明,微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶属于GH1家族,利用Ni-NTA Agarose亲和层析获得的重组β-半乳糖苷酶分子量约为64 ku。重组酶的最适反应温度为30 ℃,最适pH为4.5。温度低于25 ℃、pH 4.0~5.0条件下,β-半乳糖苷酶具有良好稳定性。重组β-半乳糖苷酶对DTT、吐温20和吐温80具有良好的耐受性;离子型去垢剂SDS和CTAB存在时,β-半乳糖苷酶几乎丧失活性。重组β-半乳糖苷酶的Km和Vmax分别为10.98 mmol/L和7.48 U/mg。结构模拟显示,微泡菌β-半乳糖苷酶的催化酸/碱残基和亲核残基分别为Glu186和Glu370。该研究为来自微泡菌ALW1的β-半乳糖苷酶在食品领域的应用奠定理论基础。     

超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究

采用超声波破碎法对嗜酸乳杆菌A和B产生的β-半乳糖苷酶进行提取,并以邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物测定了β-半乳糖苷酶的活力。通过单因素试验和正交试验,选出了超声波破碎的最佳工艺条件。实验表明,嗜酸乳杆菌A在工作时间7.6min,工作/间歇为28s/20s,温度36℃时,超声波对细胞的破碎效果较好,此条件下破碎后,A株产生的β-半乳糖苷酶活力为5.963μmolONP/L·min。嗜酸乳杆菌B在工作时间6.8min,工作/间歇为20s/20s,温度37℃时效果较好,产生的β-半乳糖苷酶活力为6.683μmolONP/L·min。因此,嗜酸乳杆菌具有较高产生β-半乳糖苷酶的能力。