不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响

以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm~27和Auman5A-R-cbm~27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)~(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的酶学特性

纯化的黑曲霉Aspergillus niger WM20-11所产的酸性β-甘露聚糖酶经Sephadex G-100凝胶过滤层析和SDS-PAGE分别测得相对分子质量为39 000和40 000;IEF-PAGE测得酶的等电点为4.0;最适作用pH值和温度分别为3.5和70℃;糖质量分数19.6%;Mg2 、Ca2 、Li 、Na 、K 对酶有激活作用,Pb2 、Co2 、Fe3 、Mn2 、Hg2 对酶有抑制作用;酶对角豆胶的Km和Vmax分别为66.7 g/L和333μmol/(min.mg);酶蛋白的氨基酸组成中Asp和Glu含量最高;HPLC分析角豆胶酶水解液的主要产物是低聚糖。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85U/mL。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃,最适pH为6.0,pH稳定范围为5.0～9.0,在低于40℃的温度下基本稳定。Fe2+、Cu2+、EDTA和NH4+对该酶有抑制作用,Na+则有激活作用。     

黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA耐热突变体的筛选

为了改造黑曲霉（Aspergillus niger）来源的β-甘露聚糖酶ManA,获得耐热性高的突变体。利用易错聚合酶链式反应（PCR）技术对构建的表达质粒pGAPZαA-manA进行随机突变,将突变文库转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,表达筛选耐热性高的突变体,并进一步对突变位点进行定点突变,筛选其他耐热性高的突变体。结果表明,ManA的H283R与H283K突变体相对于野生型在耐热性方面有显著提升,75 ℃加热30 min其相对酶活由26.66%分别提升至76.95%和83.57%;在pH 3.0～9.0的条件下,50 ℃保存24 h,H283K突变体与野生型的相对酶活均在90%以上,H283R突变体在pH 3.0时的相对酶活下降到了84.72%,两个突变体的最适温度、pH及比酶活与野生型没有明显差异。说明β-甘露聚糖酶ManA的283位组氨酸（H283）对其耐热性较为关键,将该位点突变为精氨酸（R）和赖氨酸（K）时,ManA的耐热性得到显著提升。     

枯草芽孢杆菌05表达β-甘露聚糖酶酶学性质的初步研究

从池塘淤泥中分离筛选出1株高产β-甘露聚糖酶的菌株(B. subtilis05),并对其酶学性质进行了初步研究。结果表明:酶最适温度为50℃;在4-45℃活性较稳定;β-甘露聚糖酶最适反应的酸碱度为pH8.0;Na+,K+显著地促进酶活性,NH4-抑制酶活性,Mg2+、Cu2+、Fe2+显著抑制酶活,Fe3+抑制最显著;培养10.5h后,发酵培养基的黏度为2.78Pa.s,12h后的黏度为1.55Pa.s。     

高产β-甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究

通过初筛和复筛从魔芋种植基地土壤样品中分离筛选高产β-甘露聚糖酶菌株。通过形态学观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,并对其产β-甘露聚糖酶酶学性质进行研究。结果表明,筛选出一株高产β-甘露聚糖酶的菌株,编号为HTGC-10,被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株HTGC-10在30 ℃、180 r/min条件下液体发酵24 h后,发酵液β-甘露聚糖酶活力为61.75 U/mL。酶学性质的研究结果表明,该菌株所产酶的最适反应pH值为6.0,在中性偏酸环境下稳定性较好,属于偏酸性酶;最适反应温度为55 ℃,热稳定性相对较差;乙二胺四乙酸（EDTA）和金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著。     

黑曲霉β-D甘露聚糖酶酶学性质及化学组成

在纯化研究的基础上对土壤中筛选诱变得到的黑曲霉菌株所产的β－Ｄ甘露聚糖酶进行了部分酶学性质的研究。该酶的最适温度为５５℃，最适ｐＨ为５．５，酸碱稳定区域为４．５～８．０，以魔芋精粉和瓜儿豆胶为底物分别测得该酶米氏常数为１４．２ｇ／Ｌ，１０．２ｇ／Ｌ，发现Ａｇ＋、Ｐｂ２＋离子对该酶有较强的抑制作用，Ｃａ２＋离子有一定的激活作用。纯化酶的氨基酸组成分析表明，天门冬氨酸和谷氨酸（包括酰胺）含量为２６．９％．利用纸层析初步了解了不同条件下粗酶对魔芋精粉底物的水解产物情况。     

耐热β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达及酶学性质

基于生物信息学和基因组学分析的结果,采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆出一种糖苷水解酶(GH)26家族β-甘露聚糖酶(AuMan26A)成熟肽编码基因(Auman26A),成功实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的异源表达。重组β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)的发酵上清液对角豆胶的酶活性为281.9 U/mL,纯化后比酶活为2281.7 U/mg。其最适反应温度Topt为40℃;在80℃处理60 min后残留酶活性为60%;90℃时的半衰期t1/290为10 min,处理60 min后残留酶活性仍为33%;其最适pH为5.5,在pH 5.0~7.0的范围内较稳定;Fe2+和Fe3+对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;所测酶的最适底物为角豆胶,其次是魔芋粉和瓜尔豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/mL和7 841.9 U/mg。reAuMan26A良好的热稳定性使其在食品、饲料和纺织等工业具有广阔的应用前景。     

甲壳素固定化β-甘露聚糖酶的研究

研究了甲壳素作为载体、戊二醛作为交联剂,对β-甘露聚糖酶进行固定化,通过实验对交联剂浓度、加酶量、吸附时间、吸附pH等能够影响固定化酶活力回收率的因素进行研究和优化,得出最佳的固定化条件,并对固定化后的酶学性质作了初步研究。     

固定化β-甘露聚糖酶制备甘露低聚糖的研究

研究用固定化β-甘露聚糖酶水解魔芋精粉制备甘露低聚糖的工艺.试验结果表明反应时间、魔芋精粉浓度、温度及加酶量对甘露低聚糖的制备有一定影响,其中魔芋精粉浓度和加酶量影响较大,反应温度影响较小.通过正交试验优化出的固定化β-甘露聚糖酶制备甘露低聚糖的最佳工艺条件为:魔芋精粉浓度2%;加酶量为6400U;反应温度70℃;反应时间17 h.在此条件下甘露低聚糖的得率为30.8%.     

酸性β-甘露聚糖酶固态发酵工艺与粗酶性质

用宇佐美曲霉菌株（Aspergillus usamii YL-01-78）进行固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶,其曲盘发酵的最优工艺为：培养基最初料水比为1：1.4,起始pH自然,接种量10%（相对于干物料）,通过中间补水和翻曲,31℃培养72h,最高酶活可达3183IU/g干曲.对酶学性质初步研究显示：酶的最适反应温度和pH分别为70℃和3.5,低于60℃、pH5.0～8.0酶稳定,Ca^2＋、EDTA对酶有激活作用,Mn^2＋、Pb^2＋、Sn^2＋、Fe^3＋、Cu2^＋、Al^3＋、Fe^2＋对酶有一定的抑制作用.     

CBM融合位置对AuMan5A酶学性质的影响

为探讨碳水化合物结合结构域(CBM)不同融合位置对Aspergillus usamii 5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响,将Thermotoga maritima 27家族CBM分别融合至其C和N末端,构建出融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A。将Auman5A和融合酶基因分别在Pichia pastoris GS115中表达,分析比较表达产物AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的酶学性质。结果表明:AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的最适温度Topt分别为70、70℃和60℃;其中AuMan5A-CBM27在68℃及以下保温1 h残余酶活均大于85%,与原酶相比,其热稳定性提高了约8℃,而CBM27-AuMan5A在58℃及以下保持稳定,与原酶相比,降低了2℃。3种酶的最适pH均为4.0;AuMan5A在pH值2.5～7.5范围内保持稳定,2种融合酶在pH 2.0～9.0内均能保持稳定。与AuMan5A相比,AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A对角豆胶的Km分别降低了45.0%和26.3%。通过比较3种酶的酶学性质,证实CBM不同融合位置对AuMan5A酶学性质具有重要影响。     

微生物β-甘露聚糖酶的研究进展

本文阐述β-甘露聚糖酶的来源，微生物生产方法，酶的纯化及酶学特性，同时简要介绍了β-甘露聚糖酶及其水解产物的应用。     

壳聚糖-硅胶固定化β-甘露聚糖酶方法的研究

研究了壳聚糖—硅胶作为载体,戊二醛作为交联剂,对β-甘露聚糖酶进行固定化,通过实验对交联剂浓度、加酶量、吸附时间、吸附pH等能够影响固定化酶活力回收率的因素的研究和优化,得出最佳的固定化条件,并对固定化后的酶学性质作了初步研究。      

壳聚糖-硅胶固定化β-甘露聚糖酶方法的研究

研究了壳聚糖—硅胶作为载体,戊二醛作为交联剂,对β-甘露聚糖酶进行固定化,通过实验对交联剂浓度、加酶量、吸附时间、吸附pH等能够影响固定化酶活力回收率的因素的研究和优化,得出最佳的固定化条件,并对固定化后的酶学性质作了初步研究。     

β-甘露聚糖酶产生菌的选育

本论文以魔芋、番鬼芋、土壤、海水等从自然界采集到的样品为实验材料,经过富集培养、分离纯化、选择性平板分离,筛选出产β-甘露聚糖酶的菌株,再经过平板水解圈初筛得到20株酶活较高的菌株,经过摇瓶复筛,选出一株酶活最高的菌株,其酶活为15.66U/ml.对该菌株进行60℃o诱变,经过分离、平板水解圈初筛和摇瓶复筛,得到一株酶活为31.89U/ml的菌株,其酶活是出发菌株的2.04倍.     

融合β-甘露聚糖酶基因的构建、表达及酶学性质的分析

宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)是一种仅含催化域(CM)的单结构蛋白。为改善其酶学性质,基于理性设计将海栖热胞菌(Thermotoga maritima)MSB8的27家族碳水化合物结合域(CBM27)融合至Au Man5A的C-端,并采用重叠PCR技术构建融合酶基因Auman5A-cbm27。分别将Auman5A-cbm27和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,对重组表达产物re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A进行纯化和酶学性质测定。结果表明,re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A的最适温度均为68℃;两者分别在68和60℃及以下稳定。同时,前者较后者具有更广泛的p H稳定范围。re Au Man5ACBM27对角豆胶的Km值由融合前的1.7 mg/m L降至0.7 mg/m L,表明Au Man5A的底物亲和力得到了提高。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的产酶条件

研究了培养基组分和培养条件对黑曲霉菌株Aspergillusniger LW-1固态发酵产β-甘露聚糖酶的影响。在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman和Box-Behnken实验设计确定的最佳产酶培养基组成和培养条件：麸皮与豆饼粉质量比为7.5∶2.5（g/g）,其它物质相对于固体物料的质量分数分别为魔芋粉4%,KH2PO40.3%,玉米浆5%,CaCl20.1%,MgSO40.1%,（NH4）2SO41%,液固质量比为1.5∶1,自然pH;32℃静置培养84h,期间翻曲1次。最高酶活可达24879IU/g。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶曲盘发酵与粗酶性质研究

用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)LW—1进行固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶,其曲盘(大小φ20 cm×4 cm)发酵的最优工艺为:培养基最初料水比为1:1.8,起始pH自然,接种量10%(相对于干物料),曲盘中装料150g(以干料计),通过中间补水和翻曲,32℃培养72 h,最高酶活可达22 250 IU/g(干曲)。对粗酶性质进行研究,结果表明,酶的最适反应温度和pH分别为70℃和3.5,低于60℃、pH5.0～8.0酶稳定,Zn~(2+)、Ca~(2+)、ED- TA对酶有明显的激活作用;Mn~(2+)、Fe~(2+)、pb~(2+)、Sn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Ag~+对酶有一定的抑制作用。     

β-甘露聚糖酶制备魔芋葡甘露低聚糖的研究

利用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)LW-1所产酸性β-甘露聚糖酶,对魔芋胶进行水解制备(魔芋)葡甘露低聚糖。酶解的工艺条件为:魔芋胶浓度150g/L,加酶量50IU/g(魔芋胶),酶解温度50℃,酶解时间6h。所获酶解产物经薄板层析和HPLC检测,主要为低聚糖以及少量单糖。再利用酵母发酵法去除其中的可发酵性单糖,最终产物为100%的(魔芋)葡甘露低聚糖。