新型环氧化物水解酶AuEH1的表达及酶学性质

采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001总RNA中扩增了一种新型环氧化物水解酶AuEH1的编码基因Aueh1。将该基因与表达质粒pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),获基因工程菌E.coli/Aueh1,IPTG诱导表达重组AuEH1(reAuEH1)。菌体经超声波破碎,收集上清作为reAuEH1酶液。分析结果表明,reAuEH1活性为8.12 U/mL;其最适温度为40℃,在40℃及以下稳定;最适pH为6.5,在pH 5~9范围内稳定;所测金属离子(除Ag~+和Cu~(2+)外)及EDTA对reAuEH1活性影响不大。在40 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.5)、20 mmol/L外消旋环氧苯乙烷((R,S)-SO)和0.8 U/mL reAuEH1体系(终体积6 mL)中,35℃反应50 min,所获手性产物(S)-SO的摩尔产率为30.8%、对映体过量(e.e.)值99%。     

α-溴代苯乙酮合成方法研究

考察了反应时间，温度，反应物投料比等因素对α-溴代苯乙酮产率的影响。结果表明：在5℃的条件下，往舍有5g苯乙酮的无水乙醚溶液中，缓慢滴加溴素6．56g，滴完后搅拌反应1h，α-溴代苯乙酮的产率可达75％。     

甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成

采用来自水稻的UDP-糖基转移酶EUGT11并结合染色体改造构建了大肠杆菌工程菌,用于全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)生产莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)。为了增加宿主细胞内源性糖配体葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate glucose,UDPG)的供给以满足糖基化反应需要,以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌对UDPG代谢通径进行改造,获得了一系列改造菌株SG1、SG2、SG3和SG4。其中以SG4为宿主过表达可高效催化RA合成RD的糖基转移酶EUGT11进行全细胞催化,RD产量高。随后以此工程菌为对象,对可能影响RD催化合成的条件进行了研究,结果表明50 m L培养菌液离心所收集新鲜菌体可在100 mmol/L pH 8.0磷酸钠缓冲液、80 mmol/L柠檬酸钠、体积分数0.1%Triton X100、500 g/L蔗糖、5 mmol/L Zn Cl2、42℃转化1 d的条件下催化1 mmol/L RA底物生成1112.21 mg/L RD,转化率可达98.5%。     

生物催化法水解制备N-BOC-L-α-氨基丁酸

利用实验室筛选得到的高立体选择性脂肪酶产生菌株溜曲霉(A spergillus tamarii WYC3)不对称水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯得到N-BOC-L-α-氨基丁酸,对其反应条件进行研究,确定其最优反应条件为:0.1 mol/L pH 7.2的磷酸钾缓冲液,反应温度30℃,底物浓度52.24 mmol/L,0.1 g菌粉,V(底物)∶V(丙酮)=1∶8,200 r/min恒温水浴反应6h,可获得产物N-BOC-L-α-氨基丁酸,此时e.e.s值达到99.95％,对映体选择率E值为20.11,产率为36.21％.     

醇析法结合离子交换法提取分离卵转铁蛋白

乙醇析出法结合两步弱酸性阳离子交换层析可有效地从鸡蛋清中分离纯化卵转铁蛋白,结果表明:预处理后黏度降低的蛋清经两步醇析法(45%浓度乙醇沉淀杂蛋白、59%乙醇浓度沉淀获得OVT粗品),再经两步阳离子层析法(第一步:pH8.0,20 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡,含0.5 mol/L NaCl的pH8.0,20 mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱;第二步:pH5.2,10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡,含0.5 mol/L NaCl的pH5.2,10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱)可得到纯度较高的卵转铁蛋白;SDS-PAGE电泳检测终产品的纯度大于96%。     

反应介质对脂肪酶活力及催化猪油水解和甲醇解的影响

研究了反应介质对脂肪酶活力及其催化猪油水解和甲醇解的影响,反应介质包括有机溶剂、缓冲液和甘油.实验结果表明,在脂肪酶催化猪油水解和甲醇解体系中,反应介质对脂肪酶活力和猪油转化率影响很大,添加20%(v/v)的正己烷比不添加正己烷的转化率提高8.8%,在40%的正己烷体系中添加20%(v/v)50mmol/L、pH 6.8的磷酸缓冲液比添加等量水的转化率提高29.2%,在40%的正己烷体系和20%的磷酸缓冲液体系中添加1.83%(v/v)的甘油比不添加甘油的转化率提高17.2%.     

重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生

为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21(DE3)中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH。SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa。酶学性质分析表明:该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0~8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg;Zn2+对其有明显激活作用;该酶对NADP+的亲和力大于NAD+且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg。在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0%,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力。     

利用胆固醇氧化酶转化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮

用酶法催化氧化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮相对于化学法合成具有反应简单、成本较低等优点.作者探讨了在正辛烷作为有机相的两相反应体系中,以胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮的方法.在胆固醇质量浓度为40g/L,反应时间40min、反应温度40℃、磷酸缓冲液-正辛烷体积比32、通氧40L/h及搅拌转速300r/min下,胆固醇转化率达到92%,经薄板层析及紫外扫描,发现转化产物为单一的胆甾-4-烯-3-酮.     

酵母菌谷胱甘肽合成能力比较及催化条件优化

试验收集培养了9株酵母菌,分别测定他们的细胞生物量和胞内谷胱甘肽(GSH)含量,酿酒酵母SP004细胞干重达到11.39g/L,啤酒酵母TS013胞内GSH含量达到1.5282mg/g湿细胞;验证考察了4种不同提取方法对细胞内GSH含量测定的影响,结果表明,温差破碎法提取效果较好.同时比较9株酵母菌催化合成GSH的能力,结果显示,絮凝酵母SP5 GSH合成酶活力相对较高,酶活达到2.385mg/g湿细胞,每克湿细胞催化前体氨基酸(AA)合成GSH转化率为7.76％.用单因素试验和正交试验分析法研究不同反应液体积与菌体量比、硫酸镁浓度、磷酸钾缓冲液浓度以及葡萄糖浓度对絮凝酵母SP5细胞催化前体AA合成GSH的影响,结果表明,合成GSH的适宜条件为:谷氨酸60mmol/L、半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸20mmol/L、七水合硫酸镁20mmol/L、葡萄糖0.5mol/L、pH值为7.0磷酸钾缓冲液100mmol/L,30℃下,160r/min,振荡反应时间6h.在此条件下,絮凝酵母SP5细胞GSH合成酶活力平均达到2.9498mg/g湿细胞,每克絮凝酵母SP5湿细胞催化前体AA合成GSH的转化率平均为9.60％.     

具有β-半乳糖苷酶转苷能力的菌株筛选及鉴定

以乳糖为惟一碳源,5-溴-4-氯-3-吲哚- β -D-半乳糖苷(X-gal)为显色剂,从土壤中筛选出10株产β- 半乳糖苷酶较高、生长较好的菌株.在30 ℃下发酵产酶,测定邻硝基苯- β- D-半乳糖苷(ONPG)水解能力.在50 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中,加入400 g/L乳糖和200 g/L果糖,并分别添加10株菌所产β- 半乳糖苷酶, 至酶活为400 U/L,37 ℃下反应8 h,经高效液相色谱分析,编号为2-1样品中含有乳果糖.通过形态特征和16S rDNA 序列分析,鉴定菌株2-1为节杆菌属.     

苦瓜碱提多糖调节HepG2细胞胰岛素抵抗的途径

为研究苦瓜碱提多糖(AEMP)调节胰岛素抵抗的作用途径,采用0.25 mmol/L棕榈酸诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型,并测定AEMP和二甲双胍对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量、糖原、甘油三酯(TG)及胰岛素抵抗信号通路相关基因m RNA表达水平的影响。结果表明,250,500,750μg/m L AEMP均可显著增加胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗量(从78.58%分别增至93.31%、94.57%和97.07%);750μg/m L AEMP能显著增加糖原含量(从70.78%增至95.51%),降低TG含量(从132.97%降至115.93%);AEMP还可显著提高胰岛素抵抗细胞中PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)、AKT(蛋白激酶B)和PGC-1α(过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α)m RNA的表达水平,降低PEPCK(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)m RNA的表达水平。AEMP主要通过激活胰岛素抵抗细胞的PI3K-AKT和PGC-1α信号通路改善胰岛素抵抗;而二甲双胍则主要通过激活AMPK-ACC2(腺苷酸活化蛋白激酶-乙酰辅酶A羟化酶2)和PGC-1α信号通路,调节胰岛素抵抗细胞的糖脂代谢,二者的作用途径有所不同。     

环糊精葡萄糖基转移酶生产α-熊果苷的反应条件优化及分子改造

选择4种环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)分别为来源于Paenibacillus macerans的α-CGTase,Bacillus circulans 251的β-CGTase,Bacillus stearothermophilus NO_2和Anaerobranca gottschalkii的α/β-CGTase,研究不同种类的CGTase生产α-熊果苷的情况。以麦芽糊精为供体,对苯二酚(Hydroquinone HQ)为受体,通过CGTase和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应催化合成α-熊果苷。分别优化不同类型的酶合成α-熊果苷的条件,发现Anaerobranca gottschalkii来源的CGTase在如下最优条件下获得的HQ摩尔转化率最高,为25%:以葡萄糖当量(DE)值为9%~13%的50 g/L麦芽糊精作为供体,8 g/L HQ为受体,缓冲液pH 6.0,在40℃下反应24 h,沸水浴灭活后,加入糖化酶处理,高效液相色谱检测产物。为了进一步提高CGTase对底物的转化率,利用定点突变技术对A.gottschalkii CGTase进行分子改造,得到1个突变体Y299A,在最优的反应条件下突变体的HQ转化率可达40%。     

利用重组嗜热栖热菌尿苷-胞苷激酶生产尿苷酸

尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase,UCK)作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂,可以催化尿苷和胞苷磷酸化成为尿苷酸(5'-uridine monophosphate,5'-UMP)和胞苷酸(5'-cytidine monophosphate,5'-CMP)。利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)分别成功克隆表达了来源于嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的尿苷-胞苷激酶。对比分析了不同重组尿苷-胞苷激酶的催化特性发现,来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶能以鸟苷三磷酸(Guanosine 5'-triphosphate,GTP)或者腺苷三磷酸(Adenosine 5'-triphosphate,ATP)作为磷酸供体催化尿苷生成尿苷酸,而来源于枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作为磷酸供体时的催化效果较好。在优化的反应条件下,使用来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶,6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。研究结果表明,以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶可作为一种新型的催化剂用于尿苷酸的研制与生产。     

易错PCR法提高L-氨基酸脱氨酶全细胞转化L-异亮氨酸生产α-酮-β-甲基正戊酸效率

对奇异变形杆菌Proteus mirabilis中的L-氨基酸脱氨酶进行定向进化,利用易错PCR技术向基因中引入随机突变,建立突变文库来筛选可获得较高α-酮-β-甲基正戊酸产量的突变株。突变株7/23-6最适全细胞转化反应条件是以pH 8.5 Tris-HCl为缓冲液,用900 mmol/L L-异亮氨酸在30℃下进行催化反应21～24 h,其α-酮-β-甲基正戊酸产量可以达到102 g/L,底物转化率达到87%。与对照菌相比,α-酮-β-甲基正戊酸产量和底物转化率均提高了13%,热稳定性提高了36.7%。     

生物催化2-羟基-4-甲硫基丁腈制备羟基蛋氨酸菌株的筛选及转化过程的研究

筛选得到一株产腈水解酶的基因工程菌株(ZJB12048),在优化的转化条件下(反应温度50°C,反应体系pH值7.0(100 mmol/L柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液),湿菌体浓度为0.02 g/m L,底物浓度为150 mmol/L),其静息细胞对2-羟基-4-甲硫基丁腈具有较高的催化活力。高效液相色谱(HPLC)、液相-质谱(LC-MS)和核磁共振(NMR)分析结果表明,反应液中的转化产物为羟基蛋氨酸(2-羟基-4-甲硫基丁酸)。     

壳聚糖小球共价固定化α-淀粉酶的研究

以壳聚糖小球为载体,采用戊二醛交联共价固定α-淀粉酶。试验结果表明,以1 g壳聚糖小球为载体,经5m L 2%戊二醛处理后,加入24 mgα-淀粉酶,30℃,在p H 6的磷酸缓冲液中固定化2 h,制备的固定化α-淀粉酶活力达1 407.6 U/g。固定化酶最适p H向酸性方向偏移,最适反应温度不变,固定化α-淀粉酶的酸碱稳定性和热稳定性均优于游离酶。     

pH梯度结合逆相蒸发法制备黑米麸皮花青素脂质体的研究

以大豆卵磷脂和胆固醇混合物为壁材,采用p H梯度结合逆相蒸发法制备黑米麸皮花青素脂质体,利用单因素实验,得到影响花青素脂质体包封率的三个显著性因素:大豆卵磷脂与胆固醇摩尔比(nSPC/nCH)、有机相与水相体积比(VOP/VAP)和磷酸缓冲液浓度(mmol/L)。根据中心组合(Box-Behnken)实验设计原理,采用响应面分析法对花青素脂质体的制备工艺进行了优化,结果得到花青素脂质体最佳制备工艺参数为:nSPC/nCH=3.29/1,VOP/VAP=3.16/1,磷酸缓冲液浓度为5.21 mmol/L。在最优条件下进行验证实验,得到花青素脂质体包封率达54.97%,所制备的花青素脂质体平均粒径为234 nm,Zeta电位为-25.0 m V。     

野生型和转基因型鱼腥藻混合营养方式培养的初步研究

对野生型和转基因型蓝藻进行了混合营养培养研究,这种具异型胞丝状体蓝藻被转入并表达了人肿瘤坏死因子-α基因.加入蔗糖、葡萄糖和麦芽糖3种外源有机物,结果表明都促进了两种蓝藻细胞的生长和增加了生物量,其中葡萄糖是最适合的外源有机物;用16mmol/L、26mmol/L和36mmol/L 3种不同终浓度的蔗糖进行混合培养,结果3种浓度下都能促进两种蓝藻的生长和增加生物量,其中26mmol/L的蔗糖为最适的终浓度.     

低温碱性脂肪酶型时间-温度指示剂的研究

利用碱性脂肪酶催化三乙酸甘油酯分解导致p H降低,以酸碱指示剂显示颜色变化,研究并确定低温环境的TTI(时间温度指示剂)的反应体系及基本特性。该时间温度指示剂(25 m L)的反应体系为:5 m L三乙酸甘油酯∶20 g/L聚乙烯醇乳化液(v∶v=1∶19,均质10000 r/min,每次3 min,间隔5 min,共两次)、19.50 m L 0.05 mol/L p H10.60Gly-Na OH缓冲液、0.05 m L 1 g/L碱性脂肪酶液、0.25 m L 0.10 mol/L CaCl_2溶液、0.20 m L百里香酚蓝-酚酞-百里酚酞混合指示剂。通过测定反应体系在不同温度下的p H下降速率,最终确定该反应体系的Ea为60.14 k J/mol。该反应体系可应用于监测低温环境下食品中酶反应或脂肪分解的程度,间接判断对应食品的品质状况。     

香豆素类荧光衍生试剂的合成及其柱前衍生氟虫腈HPLC-FLD检测方法的建立

以4-(二乙氨基)水杨醛为原料,经缩合成环、水解反应合成一种结构新颖的香豆素类荧光衍生试剂7-(二乙氨基)-2-氧-2H-色酮-3-羧酸（记为L1）;建立并优化L1与氟虫腈衍生化反应体系,优化后条件如下：催化缩合剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/4-二甲氨基吡啶,反应溶剂为二氯甲烷,L1与氟虫腈用量比为11∶1,反应时间为60 min,衍生温度为45 ℃;对衍生产物N-(3-氰基-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-((三氟甲基)亚磺酰基)-1H-吡唑-5-基)-7-(二乙氨基)-2-氧-2H-色酮-3-甲酰胺（记为SF1）进行分离和鉴定;在此基础上,建立氟虫腈柱前衍生化高效液相色谱-荧光检测方法,方法的检出限达到0.01 μg/L,定量限为0.036 μg/L。该方法具有较好的灵敏度、精确性和可靠性,可应用于农产品中氟虫腈残留的检测。