引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae CICC40186)木聚糖酶Ao Xyn11A的温度特性,基于其与同一糖苷水解酶家族耐热木聚糖酶Ev Xyn11TS一级和三维结构的比对和分析,在Ao Xyn11A N端空间区域引入3对盐桥。采用大引物PCR技术对野生型木聚糖酶基因(Aoxyn11A)实施定点突变,构建突变酶Ao Xyn11AS基因(Aoxyn11AS)。分别将Aoxyn11A和Aoxyn11AS在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。酶学性质分析显示:Ao Xyn11AS的最适温度(Topt)为58℃,较Ao Xyn11A提高了8℃;突变酶在50℃的半衰期(t501/2)为60 min,较原酶延长了1倍多,其在55和60℃完全丧失酶活性的时间分别由原酶的15和4 min延长至35和15 min;而突变酶的p H特性和动力学常数较原酶改变不大。在Ao Xyn11A N端空间区域引入盐桥增加了其三维结构的刚性,从而明显改善了其温度特性。     

定点饱和突变改善米曲霉木聚糖酶的温度特性

为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly~(21)。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly~(21)的密码子实施饱和突变,将pET-28a-Aoxyn11A各突变体转化E. coli BL21(DE3),构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E. coli/Aoxyn11A~(G21I))。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11A~(G21I)表达一种由Ile~(21)替换了Gly~(21)的突变酶AoXyn11A~(G21I)。温度特性分析表明:突变酶的最适温度由突变前的55℃提高至65℃;AoXyn11A~(G21I)在55℃及以下稳定,较AoXyn11A提高了7℃。另外,AoXyn11A突变前后的pH特性改变不大。     

米曲霉木聚糖酶N端引入二硫键对其热稳定性的影响

为提高源自米曲霉Aspergillus oryzae 11家族木聚糖酶(AoXyn11A)的热稳定性,对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对野生型酶AoXyn11A和一种超耐热酶EvXyn11TS的N端氨基酸残基序列进行同源比较,在野生型酶N端引入一个二硫键,获得突变酶AoXyn11AM。野生型酶和突变酶的热稳定性通过同源建模和分子动力学模拟分析评估后,其基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达并分析温度对表达产物酶活性的影响。结果表明:突变酶的最适温度由野生型酶的55℃提高至60℃;在50℃和55℃保温30 min,突变酶保留94%和45%保温处理前的酶活性,分别较野生型酶(62.5%和1.4%)有大幅度的提高。突变酶在保留了野生酶其它优良性质的基础上,提高了热稳定性,具有潜在的工业应用价值。     

N-端二硫键及芳香族氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

为提高GH11家族中温木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性,将其N-端替换成GH11家族的耐热性木聚糖酶Ev Xyn11的相应序列,并在该段序列引入芳香族氨基酸残基(P9Y、H14F),构建杂合木聚糖酶基因xyn EV-34,将木聚糖酶基因xyn ZF-2和xyn EV-34分别在E.coli BL21中表达,并分析温度和p H对酶活性的影响。结果表明,杂合木聚糖酶Xyn EV-34的最适温度为48℃,相比原酶Xyn ZF-2提高了8℃。在40℃保温1 h,原酶Xyn ZF-2残余酶活性下降到44.36%,而突变酶Xyn34残余酶活性为77.96%。在45℃,突变酶Xyn EV-34的半衰期t1/245℃为23 min,较重组酶Xyn ZF-2(t1/245℃=7 min)提高了16 min。同时,两种酶的最适p H均为5.0,但p H稳定性由原来的4.4~9.0扩增到了3.0~9.0。由此表明,二硫键以及芳香族氨基酸的引入,对该酶的热稳定性以及p H稳定性都有明显改善。     

二硫键对提高木聚糖酶AoXyn11A热稳定性的作用

为提高米曲霉11家族中温木聚糖酶Ao Xyn11A的热稳定性,将Ao Xyn11A与源于Thermomyces lanuginosus的耐热木聚糖酶Xyn A进行三维结构比对分析,发现Xyn A的α-螺旋与β9-折叠之间存在一个二硫键;基于分子动力学模拟预测结果,利用定点突变技术在Ao Xyn11A的相应位置引入二硫键(Cys108-Cys152),获得突变酶Ao Xyn11AT;分别将Ao Xyn11A及其突变酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经纯化,获得重组Ao Xyn11A和Ao Xyn11AT,并分析比较温度对其酶活性的影响。结果显示,重组Ao Xyn11AT的最适温度为60℃,比重组Ao Xyn11A提高了5℃;其在50℃下的半衰期t1/250为71 min,较重组Ao Xyn11A(t1/250=25 min)提高了近2倍。研究表明二硫键对提高Ao Xyn11A的热稳定性有重要作用。     

木聚糖酶EvXyn11TS N端区域对其耐热性贡献的生物信息学分析

系统分析了11家族木聚糖酶EvXyn11~(TS)N端区域对其耐热性的影响。在GenBank数据库中借助BLAST服务器搜寻与EvXyn11~(TS)序列同源性大于55%且温度特性已知的30种木聚糖酶;运用ClustalW2程序和MEGA 5.1软件对31种木聚糖酶进行了多序列比对及进化树构建,从中选择了包含EvXyn11~(TS)在内的8种代表性耐热和中温酶;采用生物学程序软件分析了所选酶在N端的异同点。分析结果表明,EvXyn11~(TS)N端的耐热有利氨基酸含量、β-折叠股A1和氨基酸相互作用等对其耐热性有一定的贡献。     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

嗜热裂孢菌木聚糖酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将优化后的来自嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因在毕赤酵母中进行异源表达并分析了其表达产物的酶学性质。对来源于嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因催化域进行密码子优化,人工合成优化后的木聚糖酶成熟肽基因xyl11~M,构建重组表达质粒pPIC9K-xyl11~M,将其经SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到重组工程菌GS115/xyl11~M,甲醇诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白reXyl11M经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约34 000,酶活性可达到105.3 U/m L,最适反应温度为70℃,并在30~75℃温度内较稳定;最适反应pH为6.0,在pH6.5~7.5范围内稳定;Co~(2+)、Ba~(2+)、Cu~(2+)、Li~+对酶活性有强烈的激活作用,Fe~(3+)有明显的抑制作用,其它金属离子及EDTA对re Xyl11M酶活性影响不大。结果表明xyl11M成功在毕赤酵母GS115中实现表达,且reXyl11~M的酶学特性优良。     

饱和突变改善米曲霉11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae)11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性,作者采用全质粒PCR方法对AEx11A基因(AEx11A)中编码Thr~(98)、Asn~(100)、Val~(124)、Pro~(129)和Ile~(132)的密码子实施饱和突变,构建饱和突变文库。以木聚糖酶的酶活性为指标,采用DNS法从文库中筛选出酶活性提高30%以上的转化子。对其中酶活性提高最明显的两个位点Thr~(98)和Val~(124)实施迭代饱和突变,筛选出最优突变子AEx11~(AT98D-V124Q),其纯化后的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍。此外,突变酶AEx11A~(V124T)的热稳定性较AEx11A有一定的提高,其余2个突变酶的温度特性与AEx11A差异不大。     

耐热木聚糖酶基因xyn11EM在大肠杆菌中的表达

将人工合成经密码子优化的11家族耐热木聚糖酶基因xyn11~(EM)克隆至表达质粒p ET-28a(+)中,获得重组质粒p ET-28a-xyn11~(EM)。将其转化Escherichia coli BL21(DE3),构建表达耐热木聚糖酶的重组工程菌E.coli BL21/xyn11~(EM)。用IPTG诱导表达重组木聚糖酶Xyn11~(EM)(re Xyn11~(EM)),酶活性可达47.5 U/m L。SDS-PAGE分析显示,re Xyn11~(EM)的表观相对分子质量为24 800。re Xyn11~(EM)的最适反应温度为70℃,在70℃以下稳定。最适反应p H为6.5~7.0,在p H5.0~8.0范围内稳定。大多数金属离子和EDTA对该重组酶的活性影响不大。re Xyn11~(EM)的Km和Vmax值分别为7.2 mg/m L和54.7 U/mg。结果表明xyn11~(EM)成功在E.coli中实现了异源表达,其良好的热稳定性具有较好的工业应用潜力。     

Loop结构引入半胱氨酸对木聚糖酶XynASP热稳定性的影响

为了探究Loop结构引入半胱氨酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响，以溶糖曲霉（Aspergillus saccharolyticus）JOP 1030-1木聚糖酶XynASP Loop结构为研究对象，通过定点突变技术，将第95位点天冬酰胺（Asn）突变成半胱氨酸（Cys），获得突变体XynN95C，并在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达。酶学性质分析结果表明，突变体XynN95C最适温度为50 ℃，酶活性半衰期t1/240 ℃为38 min，相比野生型XynASP分别提高了5 ℃、18 min，最适pH从6.0降至5.0。另外，XynN95C的金属离子耐受性较强，经Fe3+处理1 h，相对酶活性为93.9%，较野生型（65.9%）明显提高。由此得出，在Loop结构引入半胱氨酸可有效提高木聚糖酶的热稳定性，这为GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造又提供一新思路。     

不同来源木聚糖酶酶学性质研究

目的 研究比较4种不同来源木聚糖酶的酶学性质,为各酶在不同领域应用提供理论依据.方法 通过摇瓶发酵获得源自4种菌株的木聚糖酶粗酶液,用二硝基水杨酸（DNS）法测定各木聚糖酶的酶活性,并研究酶学性质.结果 嗜热棉毛菌、绿色木霉、泡盛曲霉和橄榄绿链霉菌来源的木聚糖酶的最适温度分别为70,60,50和60℃;最适pH分别为6,4,4和6.嗜热棉毛菌来源的木聚糖酶耐热性最强,高温60℃下,酶活性高于85％,70℃仍保持60％以上的酶活性,且在pH4～11的范围内能保持较高稳定性.另外3种来源的木聚糖酶则有较强的耐酸性.结论 嗜热棉毛菌来源的木聚糖酶有饲料添加剂方面的应用优势.另外3种来源的木聚糖酶可根据不同行业对木聚糖酶的要求,应用于食品、医药、能源、环境等领域.     

双功能木聚糖酶Xyn2083的异源表达和酶学性质研究

木聚糖酶Xyn2083来源于Clostridium clariflavum,是一种双功能木聚糖酶,包括2个催化结构域GH11、GH10(glycosyl hydrolase families,GH)和一个非催化结构域DockerinΙ。在文中,将该双功能木聚糖酶基因及GH11、GH10这2个结构域的木聚糖酶基因成功在大肠杆菌Rosetta (DE3)中进行异源表达,得到了3个重组木聚糖酶。将纯化后重组酶进行酶学性质分析,结果表明Xyn2083的最适反应温度与p H值分别为60℃、6. 0,且在60℃以下或p H 4. 5～10. 5的范围内有较好的稳定性。水解反应研究表明,Xyn2083中GH11和GH10结构域协同作用于木聚糖底物,将木聚糖水解为木糖和木二糖。     

N末端改造提高GH11家族木聚糖酶热稳定性的研究进展

木聚糖酶具有重要的工业应用价值,在食品、饲料、造纸等领域有着良好的发展前景。不同应用领域对木聚糖酶的酶学性质具有不同要求,耐热性是木聚糖酶在实际生产过程中最有应用价值的性质之一;因此,许多研究者致力于木聚糖酶耐热性机制的研究。研究发现GH11家族木聚糖酶的热稳定性与其N末端区域密切相关,可以通过N末端改造的策略有效提升GH11家族木聚糖酶的热稳定性。本文主要综述了影响GH11家族木聚糖酶热稳定性的因素、N末端改造提升木聚糖酶热稳定性的技术和方法,并对耐热木聚糖酶的应用前景进行展望,以期为GH11家族木聚糖酶的耐热性研究提供一定的参考。     

杂合木聚糖酶的设计及在毕赤酵母中的表达

人工设计合成木聚糖酶,为木聚糖酶分子改造研究提供新思路。采用合成生物学思路,以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2基因序列为基础,将N端48个氨基酸替换成Ev Xyn11 N端的34个氨基酸;引入芳香族氨基酸P9Y和H14F;在C端引入二硫键Cys38-Cys191;α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A,设计杂合酶Xyn ZL。基因全合成后,构建毕赤酵母重组表达质粒p PIC9K-ZL,将其转化酵母菌GS115,对工程菌GS115-XynZL进行单因素发酵条件优化及重组酶酶学性质测定。最佳发酵培养基为土豆培养基,最佳诱导温度为28℃,最佳种龄为20 h,最佳诱导时间为168 h,最佳诱导起始pH值为6. 5,甲醇诱导最佳体积分数为15 mL/L。重组酶酶学性质显示:最佳反应温度为55℃,最适pH值为5. 0,杂合酶Xyn ZL在毕赤酵母中表达后具有特定性质和功能,其设计方法拓宽了木聚糖酶分子改造研究的思路。     

耐热β-甘露聚糖酶基因的克隆与表达及酶学性质

基于生物信息学和基因组学分析的结果,采用RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆出一种糖苷水解酶(GH)26家族β-甘露聚糖酶(AuMan26A)成熟肽编码基因(Auman26A),成功实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的异源表达。重组β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)的发酵上清液对角豆胶的酶活性为281.9 U/mL,纯化后比酶活为2281.7 U/mg。其最适反应温度Topt为40℃;在80℃处理60 min后残留酶活性为60%;90℃时的半衰期t1/290为10 min,处理60 min后残留酶活性仍为33%;其最适pH为5.5,在pH 5.0~7.0的范围内较稳定;Fe2+和Fe3+对其有明显的抑制作用,其它所测金属离子和EDTA对其没有明显的影响;所测酶的最适底物为角豆胶,其次是魔芋粉和瓜尔豆胶,其对角豆胶的Km和Vmax值分别为15.25 mg/mL和7 841.9 U/mg。reAuMan26A良好的热稳定性使其在食品、饲料和纺织等工业具有广阔的应用前景。     

玉米皮纤维发酵培养裂褶菌的转录组分析和重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的异源表达

玉米皮是玉米淀粉加工的副产物,玉米皮纤维降解酶的开发对提高玉米皮的利用价值有重要意义。通过测定玉米皮纤维为唯一碳源发酵培养裂褶菌的转录组,共获得23 656个Unigene,平均GC含量为0. 589 7。序列分析显示共有5个木聚糖酶基因,分别属于糖苷水解酶第10家族和第11家族;有6个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,分别属于糖苷水解酶第43、51和62家族。克隆了糖苷水解酶62家族蛋白基因Sabf32,该蛋白编码序列全长975 bp,N端有21个氨基酸的信号肽序列;完成了Sabf32在毕赤酵母中的表达,并验证了Sabf32的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化活性,其最适温度为40℃,最适pH为4. 0,在pH 3. 5～5. 5和40℃下较稳定; Sabf32比酶活力为16. 18 U/mg,K_m和V_(max)分别为(3. 98±0. 32) mmol/L和(2. 59±0. 09)μmol/(min·mg)。     

毕赤酵母木聚糖酶的活力测定条件研究

为探讨毕赤酵母木聚糖酶的催化特性以及更好地发挥其催化功能,从pH、温度、底物浓度、反应时间、DNS用量、DNS显色时间等几个方面研究了木聚糖酶活性测定的最佳条件。研究结果表明,木聚糖酶酶活测定的适宜条件为:1%的木聚糖用0.05mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液配制;测定温度70℃,且该酶的热稳定性较好.在55～60℃下放置2h能保持68%以上的酶活;酶促反应时间10min;DNS用量3mL;DNS显色时间5min。     

引入中性氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

通过对黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2进行生物信息学分析,在N-端区域引入半胱氨酸,定点突变E27C,构建突变基因xyn-E27C,并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。酶学性质分析发现,突变酶Xyn-E27C的最适温度为45 ℃,与原酶XynZF-2相比提高了5 ℃。在40 ℃条件下,突变酶Xyn-E27C的半衰期t1/240 ℃为100 min,相比原酶XynZF-2（t1/245 ℃=55 min）提高了45 min。在45 ℃条件下,突变酶Xyn-E27C的半衰期t1/245 ℃为24 min,相比原酶XynZF-2（t1/245 ℃=7 min）提高了17 min;突变酶Xyn-E27C的最适pH值由5.0提高至5.5,而pH稳定范围均为5.0～9.0。因此,定点突变E27C对木聚糖酶XynZF-2的热稳定性以及最适pH值均有重要影响。