表达纤溶酶抑制剂Textilinin-1的毕赤酵母工程菌遗传稳定性分析

目的分析表达纤溶酶抑制剂Textilinin-1的毕赤酵母工程菌的遗传稳定性,为今后可能的大规模生产奠定基础。方法将分泌表达纤溶酶抑制剂Textilinin-1的毕赤酵母工程菌在YPD液体培养基中连续培养200代,对原始工程菌及第200代工程菌的菌落和细胞形态、分泌表达情况以及目的基因的拷贝数等进行检测。结果第200代工程菌在菌落特征、菌体形态、分泌表达情况、Textilinin-1基因序列及拷贝数等均与原始工程菌一致。结论该毕赤酵母工程菌具有良好的遗传稳定性,适合大规模生产。     

纤维素外切酶CbhA在大肠杆菌中的重组表达、纯化及活性研究

根据GenBank上纤维素外切酶CbhA的基因序列,设计并克隆目的基因;将目的基因克隆至表达载体pET32a,构建重组质粒pET32a-CbhA;再将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建了重组工程菌BL21(DE3)-pET32a-CbhA,探讨了诱导温度、IPTG浓度和诱导时间对重组工程菌表达量的影响。结果表明,所构建的重组工程菌在诱导温度为33℃、IPTG浓度为0.7 mmol·L~(-1)、诱导时间为8h的条件下,表达量可达到46.37 mg·L~(-1),具有较高的纤维素降解活性。该研究为纤维素酶在大肠杆菌中后续共表达和酶的放大发酵技术的建立奠定了重要基础。     

酵母工程菌细胞高密度发酵的研究进展

构建重组酵母工程菌表达抗原或细胞因子等,是研发新生物制品的趋势之一,实现酵母工程菌的高密度发酵是维持制品生产规模和降低成本的重要技术途径。本文就影响酵母工程菌高密度发酵的因素,包括菌株的生物学特性和发酵工艺特点、培养基种类及配方、发酵罐结构及性能、发酵过程各项重要工艺参数或变量的控制等及在生物制品和生物制药行业中酵母工程菌细胞高密度发酵的进展作一综述。     

HIV-1 Gag蛋白酵母工程菌表达条件的优化

<正>为了探索构建的表达HIV－1核心蛋白Gag酵母工程菌GS115/pPCGAG的最佳表达条件，我们将该酵母工程菌分别在不同条件下进行诱导表达，通过ELJSA检测培养上清中目的蛋白的表达量来分析最佳表达条件，并分析了浓缩上清时最适硫酸铵饱和度。     

含抗菌肽CC31毕赤酵母工程菌培养基及其培养条件的优化

目的筛选毕赤酵母工程菌培养基的主要组分,优化工程菌培养条件。方法采用毕赤酵母工程菌CC31发酵培养抗菌肽CC31,选取基础盐培养基(basic salt medium,BSM)为初始培养基,利用单因素试验、正交试验设计对培养基的碳源、氮源、酵母营养物进行筛选;选取最适培养基对菌种接种量、培养基初始pH值、培养温度进行培养条件优化。结果经鉴定,抗菌肽CC31相对分子质量为13 620;初始BSM培养基添加组分中碳源为3%甘油和3%葡萄糖,酵母营养物为1%酵母浸出物,氮源为1. 5%硫酸铵;在10%接种量、培养基初始pH值为6,培养温度为30℃的培养条件下,获得的抗菌肽CC31蛋白浓度可达82 mg/L。结论优化了毕赤酵母工程菌培养基组分及培养条件,获得高表达量的重组蛋白,为工业化高密度发酵提供了实验依据。     

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达

目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。     

利用基因工程菌BL21处理有机磷混合农药废水的研究

研究了悬浮状态和固定化状态的基因工程菌BL21对有机磷混合农药废水的降解特性。工程菌能快速、高效地降解有机磷混合农药,其最适底物是对硫磷,而马拉硫磷不能被工程菌降解。不同农药降解速率的差别造成了不同有机磷农药的降解过程需要用不同的动力学模型来描述。比较固定化状态和悬浮状态的工程菌的降解效果可知,固定化工程菌的降解活性较后者明显降低,其比降解速率大约仅为后者的20％。     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

降争工程菌处理染色废水的研究

采用缺氧-好氧工艺,在缺氧池中投加脱色菌,在好氧池中分别投加降解工程菌、降解高效菌和活性污泥,试验比较了这三种组合工艺对染色废水的处理效果,结果表明：脱色菌-降解工程菌工艺的效果最好,在高浓度下活性高、降解速率快、处理效果好。     

酵母中表达基因工程重组蛋白药物的研究进展

本文主要从酵母载体系统的选择、酵母表达宿主的选择、多拷贝菌株的构建、高密度发酵培养酵母细胞、应用酵母系统表达外源基因的研究现状、酵母表达系统的缺陷及对策等几个方面综述了近年来酵母表达体系在基因工程重组蛋白药物开发方面的研究进展。     

不同云芝菌株腐朽杨木过程的扫描电镜研究

本文应用扫描电镜观察研究了白腐菌云艺（Coriolusvericolor）三个菌株腐朽杨木的过程，对试材的显微形态变化以及各菌株的降解特性进行了详细描述和探讨．实验结果表明，三个菌株降解木材的性能和方式存在着差异。NFU008对木质素和纤维素均具有很强的降解能力，它在腐朽早期优先降解胞间层中的木质素并能使纤维解离，在腐朽后期，它对纤维素产生强烈降解。NFU006对木质素和纤维素的降解是同时进行的，但对纤维次生壁中木质素的降解率明显高于对纤维素的降解率。NFU019降解木质素的能力相对较弱，但对纤维素的降解能力却很强，早期它以降解出生壁的木质素为主，而在腐朽后期它对纤维素产生剧烈降解。三个菌株最终均造成纤维细胞壁不同程度的减薄和破坏。     

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。     

产青蒿二烯的人工酵母细胞的构建及发酵优化

为了异源合成抗疟疾药物青蒿素重要前体青蒿二烯, 以酿酒酵母作为底盘细胞, 利用基因工程手段构建功能人工酵母细胞。为提高基因拷贝数, 并增加重组菌株基因型的稳定性, 选择酵母基因组中多拷贝位点Delta为整合点, 实现酿酒酵母内源基因tHMGR和ERG20的过表达以及外源基因ADS的整合。过表达tHMGR和ERG20基因增加了酵母体内半萜类物质共同前体法尼基焦磷酸FPP的积累量;而导入外源基因ADS, 实现了酵母生产青蒿二烯。经过摇瓶发酵优化实验, 人工酵母菌株青蒿二烯产量为225.3 mg·L^-1;为了进一步提高青蒿二烯产量, 经过发酵过程优化和补料策略, 人工酵母菌株在5 L发酵罐中青蒿二烯产量达到1.05 g·L^-1。     

Engineering Saccharomyces cerevisiae for next generation ethanol production

Conversion of cellulose, hemicellulose or starch to ethanol via a biological route requires enzymatic conversion of these substrates to monosaccharides that can be assimilated by a fermenting organism. Consolidation of these events in a single processing step via a cellulolytic or amylolytic microorganism(s) is a promising approach to low‐cost production of fuels and chemicals. One strategy for developing a microorganism capable of such consolidated bioprocessing (CBP) involves engineering Saccharomyces cerevisiae to expresses a heterologous enzyme system enabling (hemi)cellulose or starch utilization. The fundamental principle behind consolidated bioprocessing as a microbial phenomenon has been established through the successful expression of the major (hemi)cellulolytic and amylolytic activities in S. cerevisiae. Various strains of S. cerevisiae were subsequently enabled to grow on cellobiose, amorphous and crystalline cellulose, xylan and various forms of starch through the combined expression of these activities. Furthermore, host cell engineering and adaptive evolution have yielded strains with higher levels of secreted enzymes and greater resistance to fermentation inhibitors. These breakthroughs bring the application of CBP at commercial scale ever closer. This mini‐review discusses the current status of different aspects related to the engineering of S. cerevisiae for next generation ethanol production. © 2013 Society of Chemical Industry     

酵母菌的致孔作用对PVA/CMC水凝胶性能的影响

利用酵母菌发泡制备了聚乙烯醇/羧甲基纤维素多孔水凝胶(D-PC),采用FTIR对其化学结构进行了表征和Zeta电位分析共同证明了酵母菌和材料之间的相互作用;利用SEM和BET分别对其三维网络结构进行了观察以及比表面积、孔径进行了测定;研究了D-PC在不同条件下对亚甲基蓝(MB)的去除,通过纤维素降解酶实验测试了D-PC的降解性。研究结果表明：酵母菌通过静电作用包覆在D-PC内;随着酵母菌量的增加,D-PC的比表面积增大、平均孔径减小;D-PC对MB的去除机制以化学吸附为主,且吸附动力学符合伪二级动力学方程;去除效率随着酵母菌的增加而增大,随着pH、温度的增加先增大后减小;一定条件下D-PC能降解水凝胶中的聚乙烯醇。     

生物产纤维素酶研究进展

纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂.自然界存在很多产纤维素酶的生物.综述了纤维素酶的类别、族属、结构;产纤维素酶的原生动物、后生动物及微生物菌种(细菌、真菌、放线菌等);目前已发现的编码纤维素酶的基因及其表达;纤维素酶的主要作用机理等方面的研究进展,并就今后的研究方向及重点提出了建议.     

The hydrothermal degradation of cellulosic matter to sugars and their fermentative conversion to protein

For the hydrothermal degradation of cellulosic matter, an apparatus was developed in which water is used as extraction medium. Samples, 0.15 g each, of pure cellulose (filter paper), natural straw, and ¹⁴C-labeled straw were treated at temperatures of between 200° and 275°C. Of the inserted cellulose, 65.7% was recovered at the optimum temperature as sugars and hydroxymethylfurfural. It was possible to degrade the straw selectively: at lower temperatures, the hemicellulose part of the plant matter was converted to xylose and arabinose; and then at higher temperatures, the cellulose was converted to glucose and cellobiose. At the same time, a certain amount of the sugars was transformed to furfural compounds. The growth behavior of the yeast Candida utilis (strain Weissenbach) was analyzed, using cellobiose, xylose, and glucose (standard) as carbon sources. The growth curves applying cellobiose were nearly identical to those of glucose. Xylose showed lower productivity than the hexoses. The main products of the hydrothermal degradation can, therefore, be used favorably as nutritive substances for this proteinproducing yeast.     

Engineering Bacterial Cellulose by Synthetic Biology

Synthetic biology is an advanced form of genetic manipulation that applies the principles of modularity and engineering design to reprogram cells by changing their DNA. Over the last decade, synthetic biology has begun to be applied to bacteria that naturally produce biomaterials, in order to boost material production, change material properties and to add new functionalities to the resulting material. Recent work has used synthetic biology to engineer several Komagataeibacter strains; bacteria that naturally secrete large amounts of the versatile and promising material bacterial cellulose (BC). In this review, we summarize how genetic engineering, metabolic engineering and now synthetic biology have been used in Komagataeibacter strains to alter BC, improve its production and begin to add new functionalities into this easy-to-grow material. As well as describing the milestone advances, we also look forward to what will come next from engineering bacterial cellulose by synthetic biology.