A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的非临床安全性评价

目的分析注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素活性药用成分(active pharmaceutical ingredient,API)的纯度、N-末端氨基酸序列和相对分子质量,并通过多个非临床研究试验,评价两种制品在药理、毒理特性等方面的一致性。方法采用SDS-PAGE法检测注射用A型肉毒毒素(衡力~,Lantox~,以下简称复合物)和注射用A型肉毒神经毒素(Chintox~,以下简称神经毒素)的纯度;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列比对,确证其各组分的成分;毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)检测其在非还原及还原条件下各组分的相对分子质量;单次肌肉注射、静脉注射、灌胃给予大鼠及单次肌肉注射给予食蟹猴的试验评价复合物和神经毒素的急性毒性;重复肌肉注射给予食蟹猴39周和恢复期12周的药理毒理试验评价复合物和神经毒素的长期毒性;家兔红细胞的体外溶血试验评价两者的溶血性;肌肉注射给予大鼠Ⅰ、Ⅱ段生殖毒性试验评价肉毒毒素的生殖毒性。结果神经毒素组:非还原条件下,神经毒素相对分子质量约152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约101 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约51 000、N-末端氨基酸序列PFVNKQFNYK的轻链组成;复合物组:非还原条件下,含A型肉毒神经毒素(Mr 152 000)、非毒素非血凝素蛋白(non-toxic non-HA,NTNH)(Mr 136 000)、HA70组分(Mr 57 000、17 000)、HA33组分(Mr 30 000、28 000)和HA17组分(Mr 15 000),还原条件下,则含有重链、轻链、NTNH、HA70、HA33和HA17组分。注射用A型肉毒毒素、注射用A型肉毒神经毒素单次肌肉注射和静脉注射给予大鼠,肌肉注射的最大耐受剂量≥100 U/kg,静脉注射的最大耐受剂量≥30 U/kg;单次肌肉注射给予食蟹猴所产生的急性中毒反应与死亡情况一致,最大耐受剂量均为20 U/kg,近似致死剂量为40 U/kg;反复肌肉注射给予食蟹猴的试验中,未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)均为16 U/kg;在体外对家兔红细胞无溶血作用,不引起红细胞凝聚;Ⅰ段生殖毒性试验对雄鼠生育力的NOAEL为4U/kg,对雌鼠生育力的NOAEL为8 U/kg,对孕鼠早期胚胎发育的NOAEL为16 U/kg;Ⅱ段生殖毒性试验对孕鼠的NOAEL为1 U/kg,对胚胎-胎仔毒性和致畸性的NOAEL为16 U/kg。结论注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素在食蟹猴和大鼠的急性毒性、长期毒性等试验中,剂量、动物病理解剖结果一致,进一步说明A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的药理毒理特性是相同的,且在反复肌肉注射给予食蟹猴的长期毒性试验中发现,A型肉毒神经毒素更不易产生抗体。在神经毒素灌胃试验中半数致死剂量高于复合物,表明其安全性更好。     

针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛疗效观察

目的探讨针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛的疗效。方法对我院80例面肌痉挛患者采用针刺结合A型肉毒杆菌毒素进行治疗。结果本组完全缓解71例(88.75%),明显缓解7例(8.75%),部分缓解2例(2.5%)。发生面肌无力感8例,轻微上睑下垂5例,均于1个月内自然恢复,均无全身反应,肝功能及尿常规均未见异常。结论采用针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛,简便易行,无全身反应,疗效维持时间长,费用低廉,患者易接受,值得临床推广。     

A型肉毒毒素轻链蛋白的表达及纯化

目的构建A型肉毒毒素轻链表达载体重组质粒,在大肠埃希菌中表达后,利用金属螯合层析柱纯化。方法以p GEM-Bo NT/AL轻链质粒为模板,PCR扩增Bo NT/AL基因,克隆至表达载体p ET-28(a)中,构建重组质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL,转化E.coli BL21(DE3),分别于37、30、25℃IPTG诱导表达,表达产物经Chelating Sepharose 4Fast Flow(Cu~(2+))层析柱纯化,纯化产物经尿素梯度复性。结果质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL经酶切鉴定及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,主要以包涵体形式存在,37℃诱导表达量最高,占菌体沉淀总蛋白的41%;包涵体经2%Trition-X100和2 mol/L尿素洗涤后,可去除部分杂蛋白,8 mol/L尿素能溶解大部分包涵体;经再次浓缩后,蛋白浓度可达89μg/ml,纯度达90%。结论成功克隆及表达了Bo NT/A轻链基因,为制备抗Bo NT/A轻链单链抗体以及研究肉毒中毒机制和治疗方案奠定了基础。     

注射用A型肉毒毒素的生物学特性及质量分析

目的对注射用A型肉毒毒素(Botulinum toxin type A for injection,商品名衡力,出口商品名BTXA)制品中的活性药用成分(Active pharmaceutical ingredient,API)的性质及2009～2011年生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性进行分析。方法对BTXA收获物样品进行阴离子交换层析,分离毒素复合体各组分;采用血凝试验、HPLC法、SDS-PAGE、等点聚焦电泳及N-末端氨基酸测序等方法分析A型肉毒毒素复合体及其各组分的性质;统计2009～2011年连续生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性数据,分析连续生产的工艺稳定性和质量重现性。结果 BTXA收获物样品在碱性条件下可被解离,解离出的A型肉毒神经毒素相对分子质量约为150 000,无血凝效价;BTXA的API为完整的单体,纯度均在99.5%以上;复合物和神经毒素的等电点分别为4.97、4.91,N-末端氨基酸测序结果与GenBank基本一致;在连续3年的生产过程中,原液比活性平均为3.0×107LD50/mg蛋白,BTXA成品中API载量约为5 ng/瓶。结论注射用A型肉毒毒素的活性成分是特异的复合体结构,可在碱性条件下解离出A型肉毒神经毒素;BTXA原液的比活性在连续3年的生产中持续稳定,具备很好的连续性,为临床使用的安全性提供依据。     

肉毒毒素及其疫苗研究进展

肉毒毒素是目前已知毒性最强的毒素,是引起食物中毒的常见细菌毒素之一,也是重要的生物战剂之一。本文对肉毒毒素的结构、作用机制及其疫苗的研制进行了综述。     

运用统计学优化A型肉毒毒素的SDS-PAGE染脱色方法

目的运用统计学优化A型肉毒毒素的SDS-PAGE染色和脱色方法,以便生产检定中实现数字化、标准化操作。方法以Photoshop软件对电泳凝胶扫描图采样的背景灰度值、强带灰度值和弱带灰度值作为评价指标,以不同的脱色液为实验因素,按配对设计安排实验,对实验结果进行脱色方法的统计学分析,根据配对设计分析结果,按裂区设计安排第二步实验,对实验结果进行染色和脱色方法的以统计学为主的综合分析评价。结果综合分析显示,电泳凝胶直接由考马斯亮蓝R250-磷酸-乙醇染色液加热至60℃染色2 h,0.5 mol/L KCl结合冰醋酸-甲醇脱色可获得良好效果。结论得到一种具有一定创新性的A型肉毒毒素的SDS-PAGE染脱色方法,该方法具有背景脱色浅淡均匀,条带清晰,染色和脱色液不挥发因而重复性好的优点,能够满足A型肉毒毒素生产检定的需要。     

离子色谱法测定尿液中的氟离子

离子色谱法实现了尿液中痕量F-的测定,使用溴化十六烷基二甲基铵为流动覆盖层的ODS柱。尿液中的许多无机和有机阴离子不影响F-的测定。     

A型肉毒梭菌培养基中植物水解蛋白替代胰酪蛋白胨的可行性分析

目的 对A型肉毒梭菌培养基中植物水解蛋白(tryptone substitute,TS)替代胰酪蛋白胨的可行性进行分析.方法 对培养基TS浓度进行筛选试验,选择最佳TS浓度进行放大培养,制备3批TSYG(植物水解蛋白-酵母浸出粉-葡萄糖)培养基,检测培养液产毒力;用3批TSYG培养基制备结晶毒素,检测结晶毒素收率;比较...     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

治疗用A型肉毒结晶毒素的研制及实验动物模型的建立

A型肉毒梭菌结晶毒素是以酸等电点沉淀,磷酸盐提取,核糖核酸酶处理,DEAE-A_(50)离子交换层析,硫酸铵外液透析制备的。毒力强,性能稳定,冻干制品宜于长期保存。经生化学、免疫学试验表明,毒素系神经毒素和血凝素的复合体,纯度高达2.5～2.6×10~7LD_(50)(小白鼠)/mgpr。给实验动物—恒河猴眼外肌注射能致人工斜视再给猴同眼的拮抗肌注射毒素,斜视得以矫正。可望成为一种治疗眼、面等神经、肌肉痉挛性疾病的安全,有效制剂。     

不同工艺制备的E型肉毒毒素及其类毒素的免疫原性分析

目的用不同工艺制备E型肉毒毒素,脱毒制备类毒素,并分析其免疫原性。方法分别用菌体内提取法和酸沉淀法制备E型肉毒毒素,进行毒素型特异性检定及毒力测定后,脱毒制备类毒素,参考《中国药典》三部(2010版)进行结合价、蛋白氮(PN)含量、总氮(TN)含量、p H测定及脱毒检查和毒性逆转试验。选择结合价较高的2批类毒素配制3组抗原,经家兔皮下进行基础免疫(共2针)和3程超免疫(2针/程),每针间隔14 d,每程免疫间隔30 d,均于第2针免疫后第20天,经耳缘静脉采血,分离血清,参考《中国药典》三部(2010版)附录ⅪH肉毒抗毒素效价检测法,检测抗体效价。结果 55、120 h菌体内提取毒素(201112001和201112003批)及55、120 h酸沉淀提取毒素(201112002和201112004批)均为E型肉毒毒素,毒力分别为6.2×103、5.0×102、4.5×102、6.5×103 LD50/ml;各组类毒素脱毒检查和毒性逆转试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)规定,55 h酸沉淀提取毒素其类毒素TN、PN含量最高,120 h菌体内提取毒素最低。制备的3组抗原(201112001-1、201112004-1及201112004-2批)抗原结合价分别为900、2 100和900 BU/ml;两种方法制备的类毒素按最高结合价配制抗原,免疫后的血清效价差异无统计学意义(P0.05),两种方法制备的类毒素按相同结合价配制抗原及同批类毒素配制的不同结合价抗原,免疫后的血清效价差异均有统计学意义(P0.05)。结论用酸沉淀法从120 h培养液中提取毒素可获得与55 h菌体内提取毒素相同免疫原性的类毒素。酸沉淀法操作简便,更适宜马匹免疫用E型肉毒抗原的规模化生产。     

A、B、E、F型肉毒抗毒素的制备与检定

目的　制备马抗肉毒 (Botulinum)A、B、E、F型抗毒素。方法　菌种经过复苏分离与检定后 ,采用产毒培养、酸沉、盐析及脱毒等步骤 ,制备肉毒A、B、E、F四型类毒素 (Toxoid)和试验毒素 (Testtoxin) ,免疫健康马匹。结果　各型血浆效价均超过 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》中对于抗毒素的要求 ,B型与F型的效价均超过 2倍以上 ,A型与E型也达到较好的应答水平。结论　已成功制备四型肉毒抗毒素。     

治疗用A型肉毒梭菌神经毒素全基因克隆及序列分析

目的对我国治疗用A型肉毒毒素生产用菌株Hall株神经毒素(BoNT)全基因进行克隆及序列分析,了解其遗传特性,为该制剂的质量控制提供依据。方法取生产用主代种子、工作种子,通过PCR扩增BoNT全基因片段,将其克隆至载体pGEM-T中,构建重组克隆质粒pGEM-T-BoNT,对克隆的BoNT基因进行序列测定与分析。结果测得的Hall株BoNT全基因序列3891bp,共编码1297个氨基酸。4种核苷酸的比例分别为:A:40.58%,G:16.17%,T:33.13%,C:10.13%;GC含量为26.29%,AT含量为73.71%。主代种子、工作种子核苷酸序列3591位的G变成A,为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变。序列测定结果与GenBank中登录的Hall标准株进行比较,主代种子、工作种子核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为99.99%和100%。结论 A型肉毒梭菌Hall株在实验室长期的保存和生产传代过程中,BoNT基因遗传特性非常稳定。     

离子色谱法测定硅氟酸中的硫酸根

采用离子色谱法对硅氟酸中的硫酸根进行测定。样品用盐酸挥发排除硅氟酸中的氟离子,采用883Basic IC Plus型离子色谱仪测定。方法的线性范围:0~20μg/m L,检出限:0.098μg/m L,,相关系数0.999,加标回收率在98%~103%之间。结果表明,此方法操作简单,分析速度快,准确,能满足生产需要。     

用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备

目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。     

离子色谱法测定进口天然气中的氟和氯

建立了同时测定进口天然气中氟、氯含量的离子色谱法。试样经活性炭吸附后,在160~180℃的温度下进行水蒸气蒸馏,试液中的氟和氯随着水蒸气逸出并被Na OH吸收液吸收,与基体和其他元素分离,吸收液中的氟和氯用离子色谱法测定。以高容量Ion PacAS23型阴离子分离柱(4 mm×250 mm)和Ion PacAG23型保护柱(4 mm×50 mm)为色谱柱,20 mmol/L Na OH溶液为淋洗液,用电导检测器检测。结果表明,氟和氯含量在1~25μg/m L范围内与相应的峰面积呈良好的线性关系,相关系数(R)分别为1.0000和0.9996,样品中氟、氯测定结果具有较高精密度,加标回收率均达到95%以上。     

新型JHM-1A型离子膜电解槽的应用

介绍了新型JHM-1A型3.3 m²离子膜电解槽的结构、优点和操作上的变化,利用该型号的电解槽对原电解槽进行改造,实际运行表明,改造后产能提高和电耗降低效果明显,为有关氯碱企业适当提高产量和降低电耗提供了新途径。     

HPLC法和改进型AgNO3滴定法测定肉毒毒素冻干制剂中氯化钠的方法学比较

目的：依据《中华人民共和国药典》中“通则3107氯化钠测定法”(AgNO₃滴定法),对自建高效液相色谱法(HPLC)和改进型AgNO₃滴定法在肉毒毒素制剂中氯化钠含量检测的准确性进行比较,为肉毒毒素制剂质量控制中氯化钠含量测定提供方法学依据。方法：采用AgNO₃滴定法、HPLC法和改进型AgNO₃滴定法分别对肉毒毒素制剂中氯化钠进行测定,运用SPSS 25.0软件对标准曲线进行线性回归分析,对三组方法精密度进行单因素方差分析,分别对HPLC法和改进型AgNO₃滴定法重复性测定值与标准方法测定值进行单组设计t检验。结果：HPLC法和改进型AgNO₃滴定法线性决定系数(R²)分别为0.999 9和0.999 3;AgNO₃滴定法、HPLC法和改进型AgNO₃滴定法回收率分别为95.05%～98.66%、91.74%～97.35%和93.56%～97.12%,精密度相对标准偏差分别为1.73%、0...     

2-巯基苯并噻唑在注射用丹曲林钠中的迁移试验及其评估

目的:建立高效液相色谱法测定注射用丹曲林钠中的2-巯基苯并噻的含量并对其迁移结果进行安全评估。方法:本方法采用Inertsil?ODS-SP(5μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱,流动相为甲醇和10 mmol/L乙酸铵溶液,梯度洗脱,流速0.8 m L/min,波长320 nm,柱温箱温度为40℃,进样量10μL。结果:2-巯基苯并噻唑在基体中的分离度良好;在0.102～5.11 mg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)为0.9999;精密度试验的RSD为1.36%;回收率试验的平均回收率为85.1%,均符合中国药典要求。结论:本文建立的HPLC法操作简便,能快速准确地测定注射用丹曲林钠中2-巯基苯并噻唑的含量,并对其迁移量进行分析和评估。     

QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定植物油中的黄曲霉毒素和氟虫腈

采用QuEChERS前处理技术,建立了植物油中黄曲霉毒素和氟虫腈的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的检测方法.样品经含1％(体积分数)甲酸的乙腈提取,氯化钠和无水硫酸钠盐析,QuEChERS净化,以BEH C18为分离柱,用甲醇-1 mmoL乙酸铵(含0.1％甲酸)为流动相进行梯度洗脱,在多反应监测模式...