宣酒酿造微生态系统中高产中性蛋白酶功能菌株的筛选与鉴定

为筛选和鉴定宣酒酿造微生态系统中高产中性蛋白酶的功能菌株,利用平板透明圈法和液态发酵法进行筛选,再对菌株进行分子生物学鉴定,最后应用于生产细菌麸曲。结果表明,从高温大曲中筛选了6株高产蛋白酶的芽孢杆菌,通过鉴定分别为贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌,其中贝莱斯芽孢杆菌XJXJ-002麸曲中蛋白酶活力最高,达到256.72 U/g,且该菌株麸曲符合优质细菌麸曲标准。     

一株芝麻香型白酒高温大曲细菌Q2B1的鉴定及其产酶活性研究

大曲细菌关系到白酒酿造的品质,其中酶的含量与活性与白酒的风味紧密关联。以芝麻香型白酒高温大曲优势细菌代表菌株Q2B1为研究对象,利用分子生物学技术对其分类学地位进行研究,并通过全基因组研究技术对产酶相关功能基因与代谢通路进行研究。结果表明,菌株Q2B1被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。利用传统的培养技术定性定量地检测其酶活力,发现菌株Q2B1可产淀粉酶和蛋白酶,活力分别为5.852 U/mL和26.770 U/mL;其产酶相关功能基因组长度为3 475 602 bp,包括蛋白酶编码基因以及淀粉酶编码基因,在基因水平上初步揭示了Q2B1菌株合成蛋白酶和淀粉酶的分子机理,为进一步合理开发白酒大曲微生物奠定理论基础,为提高白酒品质提供科学依据。     

白云边高温大曲中嗜热功能菌的分离筛选

采用稀释平板法从高温大曲中分离筛选得到10株耐高温细菌,经平板初筛和摇瓶复筛,获得1株淀粉酶活力较高的菌株BGG4,其酶活为99.0U/g,以及1株酸性蛋白酶活力较高的菌株BGG1,其酶活为:1270.1U/g。     

宋河酒曲中主要霉菌的鉴定及其产酶特性的研究

霉菌是酿酒大曲菌群的重要组成部分,其产酶能力影响大曲质量。对宋河中高温大曲和高温大曲中的霉菌进行分离纯化,采用形态学和18Sr DNA基因分析对主要霉菌进行鉴定,并采用透明圈法初筛主要产酶菌,半固态发酵测酶活法研究几株初筛霉菌的产酶功能。结果表明:共得到具有明显特征的10株霉菌,9株分别归属于4个属即为青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)和链格孢属(Alernaria),1株未确定;初筛得到7株均能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和酯化酶的功能霉菌,其中菌株MM9产α-淀粉酶和蛋白酶的活力较高,其酶活分别为32.45U/m L和587.50U/m L,菌株Mh2产纤维素酶活力最高达11.87U/m L;菌株MM10产酯化酶活力最高为16.03U/m L。     

易门豆豉中芽孢杆菌分离筛选及产酶特性研究

该研究从云南传统发酵豆制品易门豆豉中分离筛选获得产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶的芽孢杆菌,利用水解圈法初筛、摇瓶发酵复筛得到产酶菌株,并对产酶较高的菌株进行生长性能分析和分子生物学鉴定。结果表明,从易门豆豉中分离纯化得到64株菌,筛选得到1株产淀粉酶和蛋白酶能力均较好菌株NB-13,其淀粉酶和蛋白酶活力分别为100.64 U/m L和34.30 U/m L;1株产脂肪酶能力较好的菌株ND-21,其脂肪酶活力为39.95 U/m L;2株产纤维素酶能力较好的菌株,菌株ND-38、NB-55,其纤维素酶活力分别为1.65 U/m L和1.72 U/m L;由生长状况结果可知,菌株ND-21和NB-13富集的菌量最多,生长能力最强;菌株NB-13和NB-55分别被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,菌株ND-21、ND-38被鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。     

芝麻香型白酒高温大曲嗜热功能菌的筛选与鉴定

以芝麻香型白酒高温大曲为材料,采用55℃高温分离培养,通过平板透明圈法初筛和三角瓶固态发酵物蛋白酶活力测定复筛,分离筛选嗜热功能细菌,并结合16S rRNA基因序列分析和系统发育分析进行菌株鉴定。结果表明,55℃条件下共分离获得85株嗜热细菌,其中M5中性蛋白酶活力为96.06 U/g,优于对照菌株。菌株M5经分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.Subtilis),该菌株可制成微生物强化菌剂,应用于芝麻香型白酒的高温制曲过程中。     

产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定

从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定。结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4 U/mL~10.4 U/mL之间。经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌。     

稻花香馫香型白酒酒曲酶活测定与高通量测序分析

以稻花香馫香型白酒生产中所用到的中高温大曲(ZGW),高温大曲(GW)和根霉曲(GM)为例,测定了它们的糖化酶、液化酶、酯化酶和酸性蛋白酶活力;检测了可培养微生物种类及数量(通过稀释平板涂布法);分析了微生物群落结构组成(通过高通量测序)。酶活测定结果表明:中高温大曲(ZGW)的糖化力最高,为189.5 U/g;根霉曲(GM)的液化力、酯化力和酸性蛋白酶活力最高,分别为16.36 U/g、164.69 mg/g和189.32 U/g。传统稀释涂平板结果发现,霉菌、酵母菌、总细菌和芽孢杆菌均以中高温大曲为最高,分别达到9.07×10~2cfu/g、6.02×10~4cfu/g、1.90×10~7cfu/g和1.74×10~7cfu/g。高通量测序结果表明,中高温大曲细菌和真菌的物种多样性最高,而根霉曲的最低。在细菌属水平上,高温大曲的优势菌种有Bacillus(芽孢杆菌属),Kroppenstedtia,Thermoactinomyces(高温放线菌属),Saccharopolyspora(糖多孢菌属),Norank_f_Pseudonocardiaceae,Planifilum,Staphylococcus(葡萄球菌属)和Pediococcus(片球菌属);中高温大曲的优势菌种有Bacillus(芽孢杆菌属),Kroppenstedtia,Thermoactinomyces(高温放线菌属),Weissella(魏斯氏菌属),Lactobacillus(乳杆菌属),Pediococcus(片球菌属),Planifilum和Staphylococcus(葡萄球菌属),其中Bacillus(芽孢杆菌属)丰度最高。在真菌属水平上,高温大曲的优势菌种有Thermoascus(嗜热子囊菌属),Thermomyces(嗜热真菌属)和Aspergillus(曲霉菌属),其中Thermomyces(嗜热真菌属)丰度最高;中高温大曲的优势菌种有Thermoascus(嗜热子囊菌属),Thermomyces(嗜热真菌属),Cutaneotrichosporon,Candida(假丝酵母属),Rhizopus(根霉菌属),Aspergillus(曲霉菌属),Hyphopichia,Trichomonascus和Xeromyces(耐干霉菌属),其中丰度较高的是Thermoascus(嗜热子囊菌属)。而Rhizopus(根霉菌属)作为根霉曲中唯一的优势菌种,丰度可达99.99%。     

高产四甲基吡嗪的菌株筛选及其麸曲制作工艺优化

为提高酱香型白酒中四甲基吡嗪含量，该研究从高温大曲中筛选高产四甲基吡嗪的菌株，通过形态观察及分子生物学技术对筛选菌株进行菌种鉴定，并将筛选菌株制作成细菌麸曲，结合单因素试验和响应面法对影响麸曲芽孢数量的四个因素：水分含量、接种量、培养时间、培养温度进行优化。结果表明，筛选得到一株高产四甲基吡嗪的菌株B2，经鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。菌株B2麸曲的最佳培养条件为水分含量58%、接种量3.4%、培养时间40 h、培养温度37℃。此优化条件下制得的麸曲芽孢数量为1.21×10¹⁰ CFU/g。固态发酵6 d后四甲基吡嗪产量为0.98 mg/g，表明该麸曲具有一定的产四甲基吡嗪性能。     

酱香大曲中产中性蛋白酶嗜热细菌的筛选及鉴定

通过对成品高温大曲进行嗜热细菌的分离培养,筛选出15株嗜热菌,并且对产中性蛋白酶活力进行测定,得到菌株FBKL1.016的中性蛋白酶活力最高,达到68.3 U/g,对其个体进行形态特征、生理生化试验及分子生物学鉴定,确定其为地衣芽孢杆菌。为进一步探索酱香酒产品风格提供了研究基础。     

山西老陈醋源优良芽孢杆菌菌株的鉴定及筛选

以分离自山西老陈醋醋醅中的9株芽孢杆菌为研究对象,对菌株进行分子生物学鉴定,并对其产酶、产酸、产酯、产多酚和产乙偶姻等发酵特性综合研究。结果表明,9株芽孢菌分别被鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CP-18、CP-1853、CP-1671,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CP-803,解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CP-2430,甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）CP-6、CP-1576,漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）CP-15和球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）CP-2436。9株菌的淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶酶活分别为9.77～61.40 U/mL、7.98～54.99 U/mL和4.16～22.80 U/mL,其中菌株CP-1853的蛋白酶活最高（22.80 U/mL）,且具有较高淀粉酶活（43.22 U/mL）和纤维素酶活（38.97 U/mL）;菌株CP-18 和CP-1853产酸和产酯能力较强,分别为0.25 g/L和10.67 g/100 mL;菌株CP-803和CP-1576产多酚和乙偶姻能力较强,分别为596.38 μg/mL和1.15 mg/mL。这些优良菌株可以为山西老陈醋的提质增效起到一定强化作用。     

陶融型大曲培养贮存过程生化指标变化规律及相关性研究

以陶融型大曲为研究对象,对大曲在培养和贮存过程中生化指标的变化规律及各指标之间的相关性进行研究。结果表明:发酵初期,酵母、霉菌、细菌大量繁殖,发酵力、糖化力、蛋白酶活力、酸度等指标急剧上升;发酵中期,霉菌、酵母数量速降,一些耐热的芽孢杆菌占据优势;发酵末期,大曲微生物中细菌占主导地位。贮存至120 d时,大曲糖化力保持在700 U/g以上,液化力0.8 U/g左右,发酵力0.8 U/g左右,蛋白酶活力在40 U/g以上,酯化力在20 U/g以上,细菌数量在1.4×10⁷ CFU/g左右,酵母数量在1.9×10⁵ CFU/g左右,霉菌数量在2.0×10⁵ CFU/g左右,芽孢数量在5.6×10⁷ CFU/g左右。相关性分析表明,酸度与细菌数量、糖化力与霉菌数量、发酵力与酵母数量等指标之间呈显著正相关性,水分含量与时间、淀粉含量与时间、水分含量与氨态氮等指标之间呈显著负相关性。该研究为大曲微生物群落及其多酶体系代谢研究提供了数据参考,为改良制曲工艺及指导陶融型白酒生产提供了理论依据。     

浓香型酒醅中一株高产蛋白酶菌株的鉴定及产酶条件的优化

菌株J-1为实验室保存的高产蛋白酶菌株，分离自浓香型发酵酒醅。经过形态学及分子生物学鉴定菌株J-1为解淀粉芽孢杆菌。以蛋白酶活力为指标，通过单因素实验优化产酶条件得出：选用牛肉膏蛋白胨培养基、摇床转速200 r/min、培养温度37℃的实验条件，解淀粉芽孢杆菌所产蛋白酶活力最高，可达到39.6 U/mL。在最优条件下测定蛋白酶最适p H值和最适温度，结果显示：解淀粉芽孢杆菌所产蛋白酶的最适p H值为4.0、最适温度为30℃，并在此条件下蛋白酶活力为45.3 U/mL。结果表明：通过对解淀粉芽孢杆菌产酶条件的优化，提高了菌株蛋白酶活力。期望通过对糟醅中蛋白酶及其产酶条件的研究，能够为白酒酿造生产提供科学理论指导。     

酒曲中产凝乳酶微生物菌株的分离筛选及鉴定

针对酒曲中的微生物进行分离纯化,得到11株细菌和2株真菌,并采用酪蛋白平板法和Arima时间法筛选出了1株产凝乳酶的细菌菌株编号为LB-51。通过形态学观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌,将该产凝乳酶菌株命名为解淀粉芽孢杆菌GSBa-1。该菌株在液体LB培养基中发酵72 h产凝乳酶的凝乳活力为(431.53±15.89)SU/mL,蛋白水解活力为(5.05±0.59)U/mL,所产凝乳酶凝乳活力高而蛋白水解活力低,凝乳酶粗酶单位酶活力为1.54×10~5SU/g。解淀粉芽孢杆菌GSBa-1是分离筛选自酒曲中的一株高产凝乳酶细菌,因此其来源安全,可作为工业化候选菌株进一步研究开发。     

一株高产淀粉酶扣囊复膜孢酵母的产酶条件优化及酶学性质研究

对筛选自芝麻香型白酒高温大曲中的1株高产淀粉酶扣囊复膜孢酵母的产酶条件和酶学性质进行研究。在单因素实验的基础上,运用响应面分析,优化得到菌株最佳产酶条件:原料添加量20 g,含水量51%,接种量18%,发酵温度24℃,在此条件下,经72 h固态发酵,淀粉酶活力达到12 297 U/g,比优化前提高了约63. 96%;进一步对菌株所产淀粉酶性质进行初步研究,该淀粉酶最适作用温度为50℃,最适作用p H值为4. 0。实验结果表明,所筛选菌株产淀粉酶能力较强,性能优良,且所产淀粉酶能够适应大曲发酵的酸性高温环境,具有应用于高温大曲生产的潜力。     

鲅鱼副产物中产蛋白酶微生物的分离与表征

目的 以鲅鱼副产物为实验材料,定向筛选高产蛋白酶的野生菌株。方法 以脱脂牛奶培养基对鲅鱼副产物中的产蛋白酶微生物进行初筛,采用福林酚方法对各菌株产蛋白酶的活力进行测定,复筛出具有高产碱性蛋白酶和中性蛋白酶的野生菌株,并通过分子生物学方法(16S rDNA测序分析)对高产蛋白酶菌株进行物种鉴定。进一步通过测定高产菌发酵过程中的菌株浓度和蛋白酶活力,分析菌株随发酵时间的生长情况和产酶动力学。结果 采用选择性培养基初步筛选获得8株具有蛋白酶活性的菌株,进一步复筛发现两株菌Z3和Z8菌株产蛋白酶的能力较强[碱性蛋白酶活力分别为(393.87±19.69)、(358.87±17.94)U/mL;中性蛋白酶活力分别为(344.87±17.24)、(291.20±14.56)U/mL]。经分子生物学测序比对分析菌株Z3和Z8分别鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。对两株菌的生产情况和产酶能力进行研究,发现两株菌的产酶模式均为部分生长偶联型,枯草芽孢杆菌Z3菌株合成碱性蛋白酶和中性蛋白酶的能力优于蜡样芽孢杆菌Z8。结论 本研究从鲅鱼副产...     

浓香型成品大曲中三类水解酶的分离纯化研究

采用盐析、离子交换、分子筛筛选等方法分离、纯化浓香型大曲中糖化淀粉酶、液化淀粉酶和酸性蛋白酶,研究了3种酶的相关酶学特性。结果表明,成品浓香型大曲中,糖化淀粉酶活力均值为441.0 U/g干曲,液化淀粉酶活力为5.68 U/g干曲,酸性蛋白酶活力均值达51.2 U/g干曲。糖化淀粉酶纯化倍数平均达2.44倍,酶活回收率为2.51%,表观分子量2.5×104,液化淀粉酶的纯化倍数平均达3.24倍,酶活回收率28.28%。酸性蛋白酶纯化倍数平均达4.05倍,酶活回收率可达35.62%。     

酱香型大曲中产淀粉酶菌的分离鉴定及发酵特性研究

对酱香型大曲中高产淀粉酶菌株进行分离鉴定,并对其产酶条件和代谢产物进行研究。结合形态学指标和16S rDNA同源序列分析对筛选获得的酱香型大曲中高产淀粉酶菌株进行鉴定,以小麦、麸皮浸提液为液体发酵培养基,研究培养温度、培养基pH值、摇床转速对其产淀粉酶能力的影响。结果显示,该分离菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）,产酶最适条件为：培养温度50 ℃、初始pH值6.0、摇床转速为180 r/min,其酶活力达8 667.79 U/mL。     

中高温大曲中一株耐热地衣芽孢杆菌耐受性及产酶特性的初步研究

以中高温大曲中分离得到的一株耐热地衣芽孢杆菌为出发菌株,通过对地衣芽孢杆菌进行耐受性分析,发现其耐盐、耐p H能力较强;能耐14%的盐浓度,能耐p H范围为p H3.0~10.5;耐乙醇能力较弱,不能耐6%的乙醇浓度;耐温度能力较好,最高能耐55℃的高温。通过3种酶鉴定培养基对地衣芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力进行定性鉴定,发现在3种酶鉴定培养基上均能形成透明圈。通过对地衣芽孢杆菌的产酶特性研究发现,在液态培养条件下,地衣芽孢杆菌产淀粉酶和蛋白酶的最适时间均为36 h,最适产酶温度分别为45、40℃,最适产酶转速均为240 r/min;地衣芽孢杆菌产FPA酶和CMC酶的最适产酶时间分别为36、48 h,最适产酶温度均为30℃,最适产酶转速分别为120、90 r/min。     

通过外源添加芽孢杆菌提升北方地区高温大曲的品质

本研究主要是在高温大曲制作过程中添加贝莱斯芽孢杆菌的强化1号曲、解淀粉芽孢杆菌的强化2号曲和不添加芽孢杆菌的对照曲为研究对象，以期从微生物角度来提高北方地区高温大曲的质量，从而提升酱香型白酒的品质。通过理化指标测定、高通量测序技术、气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)技术手段分析得出：强化2号曲在糖化力、液化力、发酵力、酯化力理化指标与强化1号曲和对照曲存在显著性差异，同时强化1号曲、强化2号曲酸度也有所降低；通过高通量测序及微生物计数结果看强化2号曲的芽孢杆菌数能达到4.2×108 CFU/g、丰度占比为21.68%，其次是强化1号曲芽孢杆菌数为2.3×10⁸ CFU/g、丰度占比为18.92%，而对照曲的芽孢杆菌数为4.4×10⁷ CFU/g、丰度占比为7.48%;GC-IMS三维谱图可知两种强化曲中的风味物质含量和种类显著高于对照曲，且根据指纹图谱从强化2号曲中鉴定出多种特征性吡嗪类物质。由此可见，通过外源添加芽孢杆菌后两种强化大曲在理化指标、微生物指标、挥发性风味物质方面有所改进，进而有效提高了北方地区高温大曲的质量。