抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)重组磷蛋白(p24)多克隆抗体,并对其进行鉴定,为BDV血清免疫学检测方法的建立奠定基础。方法用本课题组前期制备的重组BDVp24蛋白经背腿部多点皮下注射免疫新西兰大白兔,共免疫4次,末次免疫后第7天采血,分离血清,采用抗原亲和纯化法纯化抗血清,ELISA法测定抗血清效价;Western blot和免疫荧光鉴定其特异性。结果制备的抗BDV p24多克隆抗体的纯度为98%,ELISA效价达1∶128 000,该抗体与重组p24蛋白和BDV感染OL细胞表达的p24蛋白均能发生特异性反应。结论成功制备了灵敏性和特异性良好的抗BDV p24多克隆抗体,为研发相关的诊断试剂和研究该病毒的感染发病机制奠定了基础。     

E型沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备E型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)多克隆抗体,并在体外检测其生物学特性。方法通过分子克隆方法构建重组表达质粒pET21a(+)/MOMP,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组MOMP蛋白,经镍螯合亲和层析胶纯化后,经皮下多点注射免疫日本大耳白兔,制备兔多克隆抗体,分别采用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。在HeLa细胞中培养E血清型Ct,通过卢戈和吉姆萨染色法观察细胞中Ct包涵体的形成情况,间接免疫荧光法检测制备的MOMP多克隆抗体对Ct天然MOMP的结合特异性。结果 Ct MOMP可在原核表达系统中高效表达;制备的兔抗MOMP多克隆抗体ELISA效价可达1∶256 000,可特异性结合、识别融合及天然的Ct MOMP。结论制备的兔抗Ct MOMP多克隆抗体效价高、特异性强,为后续进一步研究Ct的致病机制及开发新的免疫诊断制剂奠定了基础。     

埃可病毒6型表面特异性抗原VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达埃可病毒6型表面特异性蛋白VP1,并制备其多克隆抗体。方法筛选VP1蛋白氨基酸序列中抗原性强的片段,优化基因序列,分别构建重组表达质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1。将经双酶切及测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行15%SDS-PAGE鉴定。将融合蛋白VP1-GST及VP1-His分别用Glutathione resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化。以纯化后的VP1-His融合蛋白作为免疫原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,以VP1-GST融合蛋白为检测抗原,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果经双酶切及测序鉴定证明,重组质粒p GEX-4T-2-vp1和p ET-28a-vp1构建正确。VP1-GST和VP1-His融合蛋白的相对分子质量分别为38 000和19 000,两种融合蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的60%和30%,纯化后的纯度均90%。兔抗VP1血清效价为1∶320 000,可与融合蛋白VP1-GST和VP1-His发生特异性结合。结论成功原核表达了融合蛋白VP1-His和VP1-GST,且VP1-His具有良好的免疫原性,其制备的多克隆抗体的特异性较好,为埃可病毒快速检测技术的建立奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv0674蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的在大肠埃希菌(E. coli)中表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)Rv0674蛋白,纯化后制备多克隆抗体,并检测抗体效价。方法用PCR技术从MTB H37Rv基因组中扩增Rv0674基因,克隆至p EASYBlunt E1表达载体后,转化入E. coli BL21(DE3)中,用优化后的IPTG诱导表达条件表达Rv0674蛋白,His trap TM HP亲和层析柱纯化目的蛋白;将纯化的蛋白腹腔注射BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot法检测抗体效价及特异性。结果成功获得了Rv0674序列正确的重组质粒p EASY-E1-Rv0674,挑选出了高表达Rv0674基因的菌株,确定的最适表达条件为1. 0 mmol/L IPTG 28℃诱导表达8 h,获得了相对分子质量约26 500的可溶性蛋白;免疫BALB/c小鼠后,能刺激小鼠产生多克隆抗体,获得的抗血清具有良好的抗原结合特性,且效价大于1∶51 200。结论成功获得了高纯度的Rv0674蛋白,并首次制备出小鼠抗Rv0674蛋白的多克隆抗体,为进一步研究Rv0674蛋白的功能和临床诊断结核病(tuberculosis,TB)的应用奠定了基础。     

高特异性长双歧杆菌多克隆抗体的制备

目的制备高特异性长双歧杆菌多克隆抗体,为长双歧杆菌的免疫学检测提供参考。方法以破碎的长双歧杆菌细胞碎片为抗原免疫小鼠,制备抗血清;利用偶联相同抗原的磁珠,分离纯化长双歧杆菌多抗,分别采用间接ELISA、SDS-PAGE和点杂交法检测纯化多抗的效价、纯度和交叉反应性。结果所制备的纯化多抗效价约为1∶1500,回收率约为80%,纯度可达83%。纯化的多抗有效消除了与金黄葡萄球菌的非特异性交叉反应。结论已制备出高特异性的长双歧杆菌多克隆抗体,可用于长双歧杆菌制剂的菌体检测。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

小鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱα融合基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达LHRH-TAT-DNaseⅡα融合基因(LTD),并制备多克隆抗体。方法采用PCR法克隆LTD基因片段,插入p ET-28a载体,构建重组原核表达质粒p ET-28a-LTD,转化大肠埃希菌BL21(Rossetta),经IPTG诱导表达。融合蛋白经电洗脱分离纯化后,免疫獭兔,制备LTD蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗血清效价。结果构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;纯化得到的融合蛋白相对分子质量为39 270,浓度为0.5 mg/ml,可被兔抗LTD抗体识别。血清抗体效价可达1∶6 400。结论成功原核表达了DNaseⅡ融合蛋白LTD,并制备了多克隆抗体,为进一步研究DNaseⅡ蛋白体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。     

促凋亡蛋白BID多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗BID的多克隆抗体,用于检测凋亡信号转导过程中BID蛋白的表达。方法采用PCR技术合成编码BID特异性肽段的基因,构建GST融合基因表达载体,在E.coli BL21中诱导表达GST-BID多肽的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔,免疫血清经纯化后,得到抗BID的多克隆抗体,经Western blot鉴定其特异性。结果通过PCR扩增获得了BID肽段的编码基因;pGEX-6P-1-BID多肽重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;在E.coli BL21中表达了GST-BID多肽融合蛋白;纯化后蛋白纯度达95%;制备的抗BID多克隆抗体能够特异地识别BID蛋白。结论所制备的抗BID多克隆抗体可特异性检测BID蛋白。     

牛源大肠杆菌F41菌毛蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备

目的原核表达及纯化牛源产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F41菌毛蛋白,并制备F41菌毛蛋白的多克隆抗体。方法以ETEC基因组为模板,采用PCR法扩增F41菌毛基因,克隆入表达载体pQE-30,转化大肠杆菌XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析,表达产物经切胶纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot分析F41菌毛蛋白与多抗的反应原性。结果重组表达质粒pQE-30-F41经双酶切及测序证实构建正确;F41菌毛重组蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为32 000;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,纯化的重组蛋白纯度可达92%;制备的抗血清效价达1∶2.56×106以上,Western blot结果表明F41菌毛蛋白与制备的多抗具有良好的反应原性。结论已成功原核表达并纯化了F41菌毛重组蛋白,且制备了高效价的多克隆抗体,为单克隆抗体制备及其免疫检测方法的建立奠定了基础。     

酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立

目的建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据。方法制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性。以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法;梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证。结果共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7%,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合;酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25～200 ng/ml的范围内,线性关系良好(R2>0.99),最低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好;检测不同浓度的抗原回收率为97.6%～107.00%,变异系数均<10%,最低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率。结论成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测。     

凋亡相关蛋白Apr-2的融合表达及多克隆抗体的制备

目的　融合表达凋亡相关蛋白Apr 2 ,并用该融合蛋白制备多克隆抗体。方法　将凋亡相关蛋白Apr 2克隆入PGEX 4T 2原核表达载体 ,转化大肠杆菌 ,IPTG诱导重组蛋白GST Apr 2表达 ,用该融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 ,经ELISA及Westernblot检测。结果　融合表达蛋白GST Apr 2主要以包涵体的形式存在 ,表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的 4 0 %以上。抗体效价为 1∶5 0 0 0。结论　已成功地进行Apr 2的融合表达 ,并获得了该蛋白的多克隆抗体     

MUC1核心肽多克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备MUC1核心肽多克隆抗体 ,用于靶向MUC1肿瘤治疗的研究。方法　以 8R -MUC1核心肽 6重复序列重组蛋白 (8R MUCPT)为抗原免疫家兔 ,以ELISA法确定抗MUC1多克隆抗体效价 ,以Westernblot和ELISA阻断试验鉴定抗体特异性。结果　MUC1核心肽多克隆抗体效价为 1∶2 5 6 0 0 0 ,能与MUC1核心肽特异性结合。结论　利用原核表达的 8R -MUCPT蛋白 ,可有效地诱导免疫动物产生MUC1核心肽特异性抗体 ,为MUC1核心肽靶向肿瘤特异性免疫研究提供了有力的实验材料。     

绿色荧光蛋白兔多克隆抗体的制备

目的制备绿色荧光蛋白(GFP)兔多克隆抗体。方法选取GFP免疫原性较强、保守性低的98～117位氨基酸序列,利用F-moc法固相合成该段序列,经高效液相色谱纯化,MALDI-TOF-MS鉴定合成多肽的分子量后,与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰雄兔,制备抗血清,并进行Western blot鉴定。结果合成的GFP多肽经MALDI-TOF-MS分析,分子量为2497.9,与理论值相符。1∶200稀释的抗血清与转染pEGFP-N1质粒的HeLa细胞表达的增强型GFP在相对分子质量27000处有清晰的杂交信号出现。结论已成功制备了特异性较好的GFP兔多克隆抗体。     

LKB1(Thr336)磷酸化多克隆抗体的制备及其应用

目的制备LKB1(Thr336)磷酸化多克隆抗体,并以其检测细胞中LKB1的表达。方法用生物信息学方法选取LKB1Thr336位点附近10个氨基酸,且使Thr336位点磷酸化,并铰链到BSA上。以此为抗原免疫家兔,制备抗血清,纯化后通过ELISA法检测抗体效价,Westernblot法检测抗体特异性,并用LKB1抗体和p-LKB1(Thr336)抗体分别检测正常细胞及肿瘤细胞中LKB1的表达。结果纯化后的p-LKB1(Thr336)抗体效价为1∶1000;LKB1抗体不仅识别His-LKB1蛋白,而且识别p-LKB1(Thr336)抗原,而p-LKB1(Thr336)抗体仅识别p-LKB1(Thr336)抗原;在正常细胞HL7702和HEK293中,LKB1表达较多,而在HeLa细胞中,LKB1基本没有表达;在这3种细胞中,p-LKB1(Thr336)基本没有表达;在肿瘤细胞S180、COS-7和Caco2中,LKB1和p-LKB1(Thr336)均有表达,p-LKB1表达相对较多。结论已制备了特异性的p-LKB1(Thr336)多克隆抗体,LKB1-Thr336位点的磷酸化可能是某些肿瘤发生的特征,有望成为肿瘤诊断的指标之一。     

脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)基因重组原核表达质粒,表达重组蛋白,制备人LP-PLA2多克隆抗体。方法从分化的THP-1细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增LP-PLA2全长编码基因,插入原核表达载体pCold TF中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温(15℃)诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Sepharose 6FF亲和层析及DEAE-Sephadex离子交换层析后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot法检测多抗的反应原性。结果重组表达质粒pCold TF-LP-PLA2经双酶切及测序证实构建正确;TF-LP-PLA2获得可溶性表达,相对分子质量约为93 000;纯化的重组蛋白纯度可达90%,可与市售兔抗人LP-PLA2抗体反应;制备的抗血清效价达1∶5.12×106以上,反应原性良好。结论已成功原核表达了重组LP-PLA2蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为下一步制备单克隆抗体及建立LP-PLA2免疫检测方法奠定了基础。     

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法。方法制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶64,Westernblot分析显示,提纯抗体与Vero细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合。确定最佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1∶1000。Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0ng/ml时,线性关系良好,r=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好。将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义。结论已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法。     

镉离子多克隆抗体ELISA竞争法的初步建立

目的制备抗镉离子螯合物的多克隆抗体,初步建立检测镉离子的ELISA竞争法。方法用双功能螯合剂iEDTA螯合Cd2+后,再与匙血蓝蛋白(KLH)偶联,合成完全抗原(Cd-iEDTA-KLH),免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体。ELISA法检测其抗血清效价、特异性和灵敏度。结果多克隆抗体效价均大于1∶80000;特异性检测结果显示均产生了抗Cd-iEDTA抗体,与OVA、BSA无交叉反应。抗体除与Hg2+有较强的交叉反应外,同等抑制情况下,Mg2+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+与Cd2+浓度相差约1000倍,交叉反应率很低;ELISA竞争法对镉离子的检测限约为50ng/ml。结论初步建立了镉离子的ELISA竞争法,检测限达到无公害的国家卫生限量标准(100ng/g)。