臭曲霉ZU-G1 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为明确臭曲霉ZU-G1分泌的α-半乳糖苷酶的酶学性质,采用硫酸铵沉淀、分子筛层析和阴离子交换层析等方法进行分离纯化.试验结果表明:α-半乳糖苷酶的分子质量136.71 kDa,反应最适pH 5.0,最适温度60℃;在30～40℃环境中热稳定性较好,在pH 6.0环境中酸碱稳定性较好.该酶受Ag+和十二烷基磺酸钠的强烈抑制(抑制率分别为100%和93%)、Cu2+的明显抑制,而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、棉籽糖、乙二胺四乙酸和巯基乙醇对酶活性影响较小.该酶对pNPG的米氏常数Km=33.48 mmol/L,最大反应速度Vmax=238.09 mmol/(L·min).本试验结果为α-半乳糖苷酶在饲料和食品中的应用提供了一定的理论基础.     

产低温β-半乳糖苷酶菌株的筛选及其酶学性质研究

从新疆高寒冻土、冷冻乳制品及生乳中分离到101株耐冷菌,利用低温β-半乳糖苷酶筛选模型,获得1株低温酶高产菌株L2004,根据其形态特征、生理生化特性,鉴定为短芽孢杆菌属(BrevibacillusShida,1996)。在以乳糖为主要碳源的发酵培养基中,L2004菌最适生长温度和最适产酶温度分别为20、15℃。该低温酶的最适pH值为6.5,最适作用温度为33℃,0℃相对酶活为总酶活的25%,在0～0℃范围内,具有较好的稳定性。不同金属离子对β-半乳糖苷酶活性的影响为:Mn2 >Mg2 >K >Na >Ca2 >Fe2 >Hg2 >Cu2 >Zn2 。Mn2 、Mg2 增强酶活,而Hg2 、Cu2 、Zn2 抑制酶活。该酶Km值为5.29mmol/L,具低温酶特性。     

α-半乳糖苷酶酶学性质及催化反应特性

近年来,α-半乳糖苷酶的生产、应用等技术问题备受关注.将国外学者对α-半乳糖苷酶的酶学性质及催化反应特性报道做以概述,为我国α-半乳糖苷酶的性质研究和应用提供一点参考.     

β-半乳糖苷酶产生真菌的筛选及酶学性质研究

以乳糖为唯一碳源,从土壤中筛选出产β-半乳糖苷酶的37株真菌,从其中合成低聚半乳糖能力较强的Q5菌株提取胞内酶,进行酶学性质的研究,结果表明,该酶的最适pH为4.5,最适温度为55℃,在pH3-8、低于60℃时稳定;该酶被Fe2+、EDTA激活,受Pb2+、Zn2+抑制,其中被Pb2+完全抑制。     

一株产α-半乳糖苷酶菌的分离与选育

主要研究了α-半乳糖苷酶产生菌的筛选及选育。以发酵豆制品和用于食品酿造的菌株为材料,通过在平板上显示蓝色作为初筛依据,结合摇瓶复筛获得1株产α-半乳糖苷酶酶活高的曲霉菌株,其96h酶活达到22.27U/mL,初步鉴定为臭曲霉,并定名为AspergillusfoetidusZU-G。该菌株经60Co-γ辐射诱变和N+离子束诱变,其酶活比各出发菌株分别提高了20.7%和23.4%,分别达到26.88U/mL和33.18U/mL。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆表达与酶学特性分析

本研究通过对米曲霉的3个β-半乳糖苷酶基因O158、AO及O76进行了克隆与表达,成功构建了相应的重组菌GS115（p PIC-O158）、GS115（p PIC-AO）和GS115（p PIC-O76）,并获得相应的重组酶。进一步分析发现,重组酶O158、AO和O76的最适作用p H分别为4.0、5.5和7.0;最适作用温度均为50℃;在p H5.0⁷.5之间或30⁴0℃均较为稳定。Mn2+对重组酶O158、AO和O76有明显的激活作用,而Fe2+、Cu2+和Zn2+则强烈抑制它们的酶活。O158、AO和O76只对乳糖具有水解与转苷活性,而且AO对乳糖的亲和力和催化效率均高于O158和O76。此外,在所试米曲霉菌种中不存在参照基因组中的β-半乳糖苷酶基因O42。本文系统地对米曲霉的3个β-半乳糖苷酶进行了异源表达及酶学性质的研究,为其大规模生产及工业化应用奠定了基础。      

凝结芽孢杆菌RY237 β-半乳糖苷酶酶学性质研究

为研究乳品中具有应用价值的乳糖酶,以乳糖为唯一碳源,用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）法,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性达4.98 U/m L,鉴定为凝结芽孢杆菌。研究了乳糖酶的酶学性质,该酶最适反应温度和最适p H分别为50℃和6.0。该酶在温度40⁵0℃具有良好的稳定性;p H5.5⁸.0表现稳定,p H7.0出现酶活峰值。金属离子Ca²⁺、K+、Zn²⁺、Mn²⁺、Na+、Mg²⁺对酶活具有抑制作用,Cu²⁺对酶活具有完全抑制作用,EDTA对酶活具有激活作用。凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶活性高、性能优良,具有应用价值。      

黑曲霉产α-半乳糖苷酶发酵条件研究

对从黄酒麦曲中筛选得到的黑曲霉wx-07产α-半乳糖苷酶的发酵条件进行了研究。结果表明,蔗糖是产酶的最适碳源,胰蛋白胨是最适氮源,产酶的最佳发酵条件为在250mL三角瓶中装入75mL培养基,接种量约为106个/750mL孢子,30℃、150r/min振荡培养96h,α-半乳糖苷酶活力达到2.40U/mL,是优化前的约3.08倍。     

白腐真菌产木聚糖酶发酵条件的优化及酶学性质研究

通过正交实验对白腐真菌Pleurotus ostreatus SYJ042产酶条件进行了优化,研究了该酶的酶学性质。结果表明:最适发酵条件为:碳源为5%的麸皮和玉米芯(1:1),氮源为0.5%的蛋白胨,接种量为每50mL发酵液接4块菌丝块,发酵时间为8.5d。该酶的最适温度是50℃,最适pH为5.4;Zn2+、Ca2+对酶活性影响较小;Ag+、MnO2-4影响较大。     

根霉胞内α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01的菌丝体破碎液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了54.8倍,总酶活回收率达到27.3%,在SDS-PAGE上显示相对分子质量为85.6 ku的单一条带,凝胶过滤表明该酶表观相对分子质量为302 ku。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为55℃,表观Km值为(0.242±0.027)mmol/L,表观kcat/Km值为4.089×105L/(mol.s);对蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用,水解速度依次为138.3μmol/(h.mg)、19.7μmol/(h.mg)。水解活性受Fe2+和Fe3+的显著激活,但受Mn2+、Cu2+、Hg+和Mg2+等离子的强烈抑制。该酶活性在pH4.0～8.2保持稳定,在50℃时保温90 min,残余酶活达到了48%。     

Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及其酶学性质

本文利用大肠杆菌原核表达系统对来源于Geobacillus thermodenitrificans的α-半乳糖苷酶编码基因进行了重组表达,并对该酶的酶学性质进行了研究。结果表明,该α-半乳糖苷酶的分子量为100~110 kDa,以pNPG为底物时,该酶的最适反应温度为70 ℃,最适pH6.0,且该酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性;Hg+、Ag+、Cu2+离子能完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,Fe3+、Mn2+、Zn2+等离子对α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用;以pNPG为底物测得该酶的米氏常数K_m=10.04 mmol/L,最大反应速度V_max=18.25 μmol/min。     

α-鼠李糖苷酶最佳测定条件的建立及酶学性质研究

对α-鼠李糖苷酶酶活的最佳测定条件及部分酶学性质进行了研究,结果表明,α-鼠李糖苷酶的最佳测定条件为:以pH4.1的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲液,5mmol/L的pNP-Rha为底物,于45℃恒温水浴中反应4min,立即加入2ml1mol/LNa2CO3溶液终止反应,400nm测定其O.D值。α-鼠李糖苷酶适于酸性环境,最适pH4.1;该酶为热不稳定性酶,其稳定的温度范围为35～55℃;以pNP-Rha（对硝基苯基-鼠李糖苷）为底物,Km值为47.84mmol/L,Vmax为75.12U。      

α-鼠李糖苷酶最佳测定条件的建立及酶学性质研究

对α-鼠李糖苷酶酶活的最佳测定条件及部分酶学性质进行了研究,结果表明,α-鼠李糖苷酶的最佳测定条件为:以pH4.1的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲液,5mmol/L的pNP-Rha为底物,于45℃恒温水浴中反应4min,立即加入2ml1mol/LNa2CO3溶液终止反应,400nm测定其O.D值。α-鼠李糖苷酶适于酸性环境,最适pH4.1;该酶为热不稳定性酶,其稳定的温度范围为35～55℃;以pNP-Rha(对硝基苯基-鼠李糖苷)为底物,Km值为47.84mmol/L,Vmax为75.12U。     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

黑曲霉耐酸性α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

采用耐酸性黑曲霉(Aspergillus niger L.)发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过聚乙二醇6000-KH2PO4双水相萃取、Sephadex G-100凝胶过滤,获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化倍数为36.4,总酶活力回收率达到70%。凝胶过滤表明:该酶表观分子质量为125kD,SDS-PAGE显示其分子质量为58.5kD。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.0,最适温度为65℃,表观Km值为0.915mmol/L,表观kcat/Km值为1.07×105L/(mol.s);水解蜜二糖的表观Km、kcat/Km值分别是21.0mmol/L、9.96×103L/(mol.s);对棉子糖只有微弱的水解作用。水解活性受多种金属离子的普遍抑制,其中Fe3+、Fe2+、Mn2+、Hg+等强烈抑制酶活力。该酶活力在pH1.5～8.2保持稳定,在60℃时保温60min,剩余酶活力达到了60%,是一种热稳定酸性α-半乳糖苷酶。     

米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究

研究了反应时间、乳糖浓度、温度、加酶量、pH对低聚半乳糖合成的影响,结果表明,加酶量、乳糖浓度、反应温度的影响较大。通过正交实验确定的米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳工艺条件为:pH6.0、温度55℃、乳糖浓度40%、加酶量40U/g、反应时间32h。在最佳工艺条件下,低聚半乳糖的合成率为32.4%。      

低温β-半乳糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

对来自新疆天山冻土的Rahnella sp.R3所产的胞内低温β-半乳糖苷酶进行纯化,并对其酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Q Sepharose High Performance阴离子交换层析、Sephacryl S-200High Resolution凝胶过滤层析,得到电泳纯酶。酶的活性回收率为21.3%,纯化倍数为35.6,比酶活由1.28U/mg提高到45.54U/mg。SDS-PAGE电泳显示其表观分子量为57.3kDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,在15℃时的酶活为最高酶活的40%,4℃时的酶活为最高酶活的23%。该酶对热敏感,45℃保温45min酶活全部丧失。纯酶的最适pH为7.0,在pH 6.5~7.5时保持稳定。5 mmol/L Na+、Ca2+、Cu2+、Al 3+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,其中Al 3+抑制作用最强,Na+、Ca2+抑制作用不明显。5 mmol/L Mg2+、K+对酶活力具有促进作用,其中Mg2+促进作用较强,使酶活提高到1.19倍。25℃以ONPG为底物的Vmax,Km值分别为7.19mol/(min·mL)、4.64mmol/L。     

产环状糊精葡萄糖基转移酶菌株发酵条件和部分酶学性质的研究

环状糊精葡萄糖基转移酶是催化淀粉等水解为环状糊精的酶,环状糊精因其特有的理化性质,在食品等领域有着广泛的应用。本实验以一株环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株LZ-10为研究对象,分别对该菌发酵培养基的碳源、氮源和pH进行了单因子分析,并对这三个因素进行了正交实验,最终得到该菌的最佳发酵条件。对粗酶的酶学性质研究表明,酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH为9.0,酶学特性非常适合于环状糊精的工业化生产。      

产β-半乳糖苷酶酵母菌株15D产酶条件研究

从马克斯克鲁维酵母的突变菌株中,获得了一株高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株15D。本文对菌株15D的产酶条件及小型发酵培养实验进行研究,表明在适宜条件下菌株15D产酶水平可达287.8U/mL,比出发菌产酶水平提高了5倍。