超声波破碎法提取活性污泥DNA及其DGGE分析

为快速提取活性污泥中的微生物DNA,进一步应用于变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析其群落结构,采用细胞超声波破碎法直接提取反应器活性污泥DNA,以16S rRNA V3区域通用引物进行PCR扩增,随后利用DGGE技术对扩增产物的多样性进行评估.结果表明,超声波破碎法可以快速地提取活性污泥DNA,用超声波破碎法提取到的活性污泥克服了PCR扩增困难的问题.在一定的超声波功率下,超声时间对DNA产率、PCR扩增效率和DGGE分析均有很大影响,实验的最佳超声时间为27 s.DGGE分析表明,用该法提取到的DNA种类较为丰富,多样性较好,种群强度最高能达到0.7 OD,能够进一步应用于群落结构分析.     

PCR—DGGE用于浓香型大曲微生物群落分析的条件优化

试验对浓香型大曲微生物群落的PCR—DGGE电泳最佳变性剂梯度范围、电泳时间进行了优化。结果表明：细菌DGGE电泳最佳变性剂浓度梯度为35％～55％;而真菌DGGE电泳最佳变性剂浓度梯度为30％～50％。通过时间进程法得出最佳电泳时间为16小时。运用此优化后的PCR—DGGE技术对不同时期曲药微生物群落进行了研究,获得了较丰富的微生物多样性。     

生活污水污泥驯化过程中细菌多样性及演替规律

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析了实验室生活污水处理系统(Anoxic/Oxic工艺)好氧池内细菌多样性及演替规律,推究污泥中优势细菌与水质变化之间的关系.提取不同驯化时期污泥的细菌总DNA,以细菌的通用引物PCR扩增16S rRNA基因V3区,DGGE分析扩增产物,并对优势细菌的DNA片段进行回收、序列分析;构建驯化稳定后污泥的16SrDNA克隆文库.结果表明:系统内细菌群落结构随污泥驯化过程的进行发生了明显的演替变化,克隆文库的序列分析表明污泥中细菌种群具有丰富的多样性,主要包括Proteobacteria类群,Bacteroidetes类群,Firmicutes类群,Zoogloea sp.,Pseudomonas sp.,Rhodobacter sp.,Planctomyces sp.,Clostridium sp.等.DGGE优势条带的测序结果结合水质处理效果分析表明:Proteobacteria类群,Pedobacter sp.,Sphingobacterium sp.对CODcr的去除起到了关键的作用.     

快速筛检活性污泥中硫酸盐还原菌的新方法

由于硫酸盐还原菌(SRB)的生物学多样性以及在系统发育学上的分散性,采用传统方法筛选活性污泥中的SRB准确率不高,且耗时、耗力,而直接采用16S rRNA基因(rDNA)序列分析方法既耗资又不适合从大量细菌中检测SRB.本研究开发出一种新方法,采用SRB16S rDNA特异引物SRB385F为正向引物,真细菌通用引物EUB926R为反向引物,通过梯度PCR,选择适当的退火温度来扩增SRB通用培养基分离的细菌,通过扩增条带与阳性和阴性对照比较,判断待检测菌株是否为SRB,整个过程仅需6h即可完成.将测试菌株进行16S rDNA测序表明该技术获得的阳性菌株全部为SRB.     

处理垃圾渗滤液复合式膜生物反应器中微生物群落结构的演变和分析

为了揭示复合式膜生物反应器中微生物群落结构多样性的演变过程,为改进工艺提供依据,分别3次从反应器混合液中和生物膜上采集样品并提取样品的微生物总DNA,然后使用V6-V8区引物对(GC968F/1492R)进行PCR扩增,最后用PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE).DGGE分析表明,在反应器运行初期微生物群落结构变化较大;在整个反应器运行过程中,微生物群落多样性较高;在该系统中,由于有生物填料的存在,可能存在厌氧微环境,所以在该反应器中可能存在短程脱氮和同步脱氮.在反应器运行约2个月时,出现的一些菌群是膜污染物产生和累积的主要因素.     

处理垃圾渗滤液复合式膜生物反应器中微生物群落结构的演变和分析

为了研究复合式膜生物反应器中微生物群落结构多样性的演变过程,为改进工艺提供依据,3次分别从反应器中的混合液和生物膜上采集样品并提取6个样品的微生物总DNA,然后使用V6-V8区引物对(GC968F/1492R)进行PCR扩增,最后用PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE).DGGE分析表明,在反应器运行初期,微生物群落结构变化较大.在整个反应器运行过程中,微生物群落多样性较高.在该系统中,由于有生物填料的存在,可能存在厌氧微环境,所以在该反应器中可能存在短程脱氮和同步脱氮.在反应器运行约2个月时,出现的一些菌群是膜污染物产生和累积的主要因素.     

PCR-DGGE在真菌群落研究中的应用解析

论述了变性梯度凝胶电泳（DGGE）在真菌群落结构研究中的技术应用的主要步骤：从样品中直接提取真菌DNA,选取5′端含GC夹的特异性引物对18S rDNA或IST序列等的部分片段进行扩增,得到合适的目的DNA片段,并在变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,使不同来源的真菌DNA片段有效分离,再进行各种分类分析。     

PCR-DGGE技术分析浸矿体系细菌群落结构的实验优化

为了研究低品位黄铜矿细菌搅拌浸出的浸矿菌液中的细菌群落结构,对 PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术相关的实验方法进行了优化,主要涉及低丰度基因组 DNA提取方法优化、16SrRNA基因的 PCR扩增条件优化以及变性梯度凝胶电泳条件的优化.结果表明,采用分级离心多次浓缩的方法收集矿浆样品中的菌体,再用试剂盒提取基因组 DNA,有较好效果;使用含特定“GC夹板”的引物5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3′进行热启动降落 PCR,能显著提高目的条带的 PCR扩增效率;当 DGGE电泳设置温度为60℃左右,胶浓度为6%,尿素变性梯度为30%~50%,恒定电压为100V,时间为9h时,可以获得效果较好的 DGGE电泳图谱,该优化方案提高了对浸矿体系中细菌群落结构的检测效果     

珍稀药用植物竹节参SRAP-PCR反应体系的构建与优化

人参属重要的药用植物竹节参(Panax japonicus C.A.Mey)野生资源已近濒危,开展其遗传多样性研究对于资源保护和可持续利用具有重要意义。研究构建并优化了竹节参DNA的SRAP-PCR扩增体系。以竹节参根茎为材料,对PCR反应体系中的d NTPs、DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶浓度和复性第二阶段的退火温度等条件进行探索和研究,得到了能稳定扩增竹节参基因组的最佳反应体系(25μl):DNA 40ng,d NTPs 0.2 mmol/L,Primer 0.36μmol/L,10×PCR Buffer 2.5 ul,Taq DNA polymerase 2U,退火温度50℃。进一步检测了随机组合的24对引物,进行扩增,得到了2对带型清楚、重复性较好的引物Me1/Em5和Me3/Em1。以这2对引物对10个不同产地竹节参DNA样品进行SRAP-PCR扩增。产物的电泳图谱表明,竹节参不同产地的DNA谱带多态性丰富,带型清晰,重复性好。说明建立的该SRAP-PCR反应体系稳定可靠,为利用SRAP分子标记技术研究竹节参的植物遗传多样性奠定了工作基础。     

运用PCR-DGGE和克隆技术对串联附积床系统生物膜菌群的分析

采用PCR-DGGE﹑克隆等分子生物学手段研究了多级串联附积床同时硝化反硝化脱氮系统生物膜菌群的时间演变,并对生物膜菌群进行同源性分析和系统发育树构建,同时讨论了生物膜菌群对系统中有机物的去除及对同时硝化反硝化脱氮的贡献.结果表明,随着时间的推移,生物膜菌群发生了较大演变而且具有高度多样性.对DGGE图谱优势条带进行分析表明,优势菌群分为5个不同的细菌类群:β-变形菌类群(β-proteobacteria)﹑γ-变形菌类群(γ-proteobacteria)、未分类菌类群(unclassified bacteria)、α-变形菌类群(α-proteobacteria)、放线菌类群(Actinobacteria).β-变形菌类群不仅在数量上占有优势,而且在有机物的降解、营养物质的去除中起着重要作用.生物膜细菌中起硝化作用的主要是亚硝化单胞菌和硝化螺旋菌;起反硝化作用的主要是施氏假单胞菌.     

BEAC工艺中微生物群落变化和种群稳定性

为了解生物增强活性炭(BEAC)上微生物群落变化和种群的稳定性,从运行13 d、26 d和39 d的BEAC炭柱的上层、中层、下层进行取样,通过细胞裂解来获取基因组DNA,纯化后,用对细菌16S rDNA基因V3区具有特异性的通用引物F357-GC和R518对其进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,得到长约250 bp的PCR产物.用变性梯度凝胶电泳(DGGE)对PCR产物进行分离,获得炭柱内微生物群落的16S rDNA基因V3区的指纹图谱.研究表明:随着反应器的运行,活性炭柱内微生物的群落结构、种类以及数量都具有时序动态性;原水带入的其他菌的种类和数量不断减少;人工强化固定的5株菌一直存在,它们在空间上呈现不同的分布,这些菌经历了动态的演替后,逐渐成为优势菌群,群落结构趋于稳定.固定化菌群的稳定性从根本上保证了整个系统的运行和处理效果的稳定性.     

水体微生物多样性PCR-DGGE分析方法的比较研究

PCR-DGGE法是一种分析微生物群落和微生物多样性的分子生物学技术.阐述了在应用PCR-DGGE分析水体微生物多样性研究当中进行优化菌体收集、DNA提取、凝胶染色的方法,结果表明:用过滤法收集菌体更具完整性,用CTAB法提取环境总DNA最佳,用16 h电泳更具可信度,银染法优于EB法.     

水体微生物多样性PCR-DGGE分析方法的比较研究

PCR-DGGE法是一种分析微生物群落和微生物多样性的分子生物学技术．阐述了在应用PCR-DGGE分析水体微生物多样性研究当中进行优化菌体收集、DNA提取、凝胶染色的方法，结果表明：用过滤法收集菌体更具完整性，用CTAB法提取环境总DNA最佳，用16h电泳更具可信度，银染法优于EB法．