单核细胞增生李斯特菌质粒DNA参考物质的研制

目的 研制一种能够用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)的质粒DNA标准物质.方法 设计一种质粒DNA包含目前常用于单增李斯特菌检测的hlyA、plcB、inlA基因,并对其稳定性、均匀性和量值可追溯性进行评价.评估其在实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测中的适用性.结果 质粒DNA参考物质的最终定值...     

单核细胞增生李斯特菌在蜂产品中的生存及检测

目的:为了保障蜂产品免受致病性单核细胞增生李斯特菌的威胁,对蜂产品中单核细胞增生李斯特菌进行检测。方法:采用培养和分子生物学的检测方法研究蜂产品中致病性单核细胞增生李斯特菌的污染状况。将高浓度的病原菌人工污染到蜂蜜和蜂王浆中,室温存放一定时间后,在选择性培养基上增菌培养;以毒力基因hly和16sRNA基因为靶序列,建立双重PCR检测病原菌的方法;以5’、3’端标记FAM、TAMRA的hly基因探针进行荧光定量PCR检测。结果:单增李斯特菌在蜂蜜中的存活时间为5d,而在蜂王浆中不能存活。对未经增菌的人工污染蜂产品采用溶菌酶+蛋白酶K的方法提取DNA,同时采用本实验中建立的双重PCR和荧光定量PCR方法检测,蜂蜜中单增李斯特菌含量均为102CFU/mL。采用这两种方法可在8h内完成蜂蜜中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。结论:单增李斯特菌能够在蜂蜜中存活数天,几乎不继续繁殖,而在蜂王浆中不能存活。     

单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的研制

目的:建立一种用于单核细胞增生李斯特菌快速检测的荧光定量PCR试剂盒.方法:根据本课题组前期工作基础,针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计TaqMan探针和引物,建立荧光定量PCR检测方法,将反应试剂组装成试剂盒,并对该试剂盒的各项参数进行评价.结果:特异性试验表明,组装的试剂盒对8林单核细胞增生李斯特菌标准菌株的检测均呈阳性反应,对6株其它种的李斯特菌及13株食品(环境)中常见的非李斯特污染菌(如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌)呈阴性反应.该试剂盒的基因组DNA检测灵敏度为3.94fg/反应(约合1.34CFU/反应).该试剂盒批内平均变异系数为2.2%,批间变异系数为1.9%,具有良好的重复性;同时稳定性强,反复冻融处理对其无明显影响;可在-20℃下避光保存1年.结论:该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,可应用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测.     

单核细胞增生李斯特菌的毒力因子

目的单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)属于革兰阳性无芽孢杆菌李斯特菌属,主要通过食物传播。Lm的致病性与毒力因子密切相关,研究其毒力因子对认识致病机理有着重要意义。方法对Lm重要的毒力因子(溶血素、磷脂酶、内化素、肌动蛋白、P60蛋白等)进行综述。结果溶血素是一个多功能的毒力因子,对于Lm逃离吞噬细胞囊是必需的。Lm能产生两种磷脂酶C:磷脂酰肌醇磷脂酶C和磷脂酰胆碱磷脂酶C,协助细菌的细胞内复制。肌动蛋白使得Lm在宿主细胞间能够扩散。内化素与Lm的侵袭力有关。P60蛋白是Lm的主要免疫原性抗原。结论Lm毒力因子研究的深入对李斯特菌病的防治将带来深远的影响。     

单核细胞增生李斯特菌菌株分型与其致病潜力基因相关性研究进展

单核细胞增生李斯特菌是一种常见的食源性致病菌,该菌分型繁多。不同分型的单核细胞增生李斯特菌致病潜力不同,这与菌株所携带的抗性基因和毒力基因不同有关。本文综述了不同分型单核细胞增生李斯特菌与抗性基因和毒力基因的关系,结果发现与该菌抗性相关的基因,如热抗性、耐冷性、酸抗性、耐高渗、耐干燥、耐金属和杀菌剂及参与应激蛋白表达调控的基因较多,它们与分型之间的关系暂无明确相关性结论,但也发现应激生存岛（stress survival island,SSI）-1仅存在于谱系I和谱系II部分菌株中,SSI-2目前仅被发现在ST121菌株中携带。从功能毒力基因和李斯特菌毒力基因岛（Listeria pathogenicity islands,LIPI）两方面分述了毒力基因,LIPI-3和LIPI-4主要存在于谱系I菌株中。此外,ST5、ST8、ST9和ST121菌株的inlA基因中出现提前终止密码子,使得菌株的毒力降低。研究不同分型单核细胞增生李斯特菌致病潜力基因的差异有助于单核细胞增生李斯特菌的预警预测、防控,并为不同分型菌株致病机制的深入研究提供参考。     

双重荧光定量PCR检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

目的建立双重荧光定量PCR方法,快速检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌。方法通过设计特异性引物和探针,扩增沙门菌的fimY基因和单核细胞增生李斯特菌的hly基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外7株肠道致病菌评价检测体系的特异性;建立了沙门菌和单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了同时检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌的双重荧光定量PCR方法,从DNA提取到检测完毕仅需2.5 h。检测两种病原菌的灵敏度分别为11和12.8 copies/μl,特异性为100%,符合率为93.3%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中很有应用前景。     

中国食源性单核细胞增生李斯特菌耐药特征分析

目的研究中国22个省市自治区9类食品中分离的单核细胞增生李斯特菌的耐药特征。方法采用微量肉汤稀释法测定了1 069株单核细胞增生李斯特菌对庆大霉素、氨苄西林、青霉素、四环素、强力霉素、亚胺培南、红霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、头孢噻吩、利福平、万古霉素、氯霉素、氨苄西林/舒巴坦酸和复方新诺明15种抗生素的耐药性。结果 1 069株单核细胞增生李斯特菌耐药率为6.92%,主要耐受的抗生素有四环素、强力霉素、红霉素、氯霉素和环丙沙星,并出现了多重耐药株。在不同食品来源中,分离自速冻米面制品的菌株耐药率最高,为9.64%。在22个省市自治区中,耐药率前3位的是:甘肃、吉林、福建,分别为27.3%、20.4%和17.4%。结论中国食源性单核细胞增生李斯特菌的耐药率较低,不同地区、不同食物来源耐药率差异较大,仍要加强对生产和临床使用抗生素的管理,减缓单核细胞增生李斯特菌耐药趋势的上升。     

单核细胞增生李斯特菌进化家系的研究进展

单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）是危害严重的食源性致病菌之一,作为一种兼性厌氧的革兰氏阳性短杆菌,广泛存在于食品、环境及动物宿主体内。根据分子特征和流行情况的不同,可将其分成4 个进化家系,不同家系的菌株毒力和致病性各不相同。本文分析归纳了单增李斯特菌不同进化家系的特点,总结概述了其致病性和流行特征等,以期为研究与单增李斯特菌家系有关的食源性疾病提供一定参考。     

单核细胞增生性李斯特菌分子分型研究进展

近年来出现了各种灵敏、快速、自动化并且易于操作的分子分型方法。为了解各种分型方法应用于单核细胞增生性李斯特菌对食品链中食源性疾病监测、暴发的诊断及溯源的重要意义,对单核细胞增生性李斯特菌各种分子分型方法进行综述性介绍。     

单核细胞增生李斯特菌复合抑菌剂的研究

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)在0～4℃也能生长,为确保冷却肉卫生安全,必须阻止肉中污染的LM的生长繁殖。本实验通过研究不同抑菌剂对3株LM的最小抑菌浓度(MIC),选取了ε-聚赖氨酸、Nisin、曲酸三种抑菌剂,利用响应面法找出最佳组合。结果表明:ε-聚赖氨酸、Nisin、曲酸对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度分别为50μg/mL、200μg/mL、6.4mg/mL。当ε-聚赖氨酸、Nisin、曲酸的浓度分别为20.5μg/mL、184.6μg/mL、4.37mg/mL时对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用最佳。     

单核细胞增生李斯特菌复合抑菌剂的研究

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）在0～4℃也能生长,为确保冷却肉卫生安全,必须阻止肉中污染的LM的生长繁殖。本实验通过研究不同抑菌剂对3株LM的最小抑菌浓度（MIC）,选取了ε-聚赖氨酸、Nisin、曲酸三种抑菌剂,利用响应面法找出最佳组合。结果表明:ε-聚赖氨酸、Nisin、曲酸对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度分别为50μg/mL、200μg/mL、6.4mg/mL。当ε-聚赖氨酸、Nisin、曲酸的浓度分别为20.5μg/mL、184.6μg/mL、4.37mg/mL时对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用最佳。      

单核细胞增生性李斯特菌自溶素研究进展

自溶素是由细菌产生的可以降解细菌细胞壁的肽聚糖水解酶,参与细菌的分裂、细胞壁更新、细菌自溶等生理过程。自溶素也是细菌的重要毒力因子之一,参与细菌的黏附与侵袭,与细菌的致病性密切相关。本文对单核细胞增生性李斯特菌的胞壁水解酶p60、酰胺酶Ami、自溶素IspC、自溶素Auto与胞壁水解酶MurA等自溶素的蛋白结构、生理功能及致病性进行了简要介绍。     

单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品的 制备与验证

目的研究制备适用于验证、评价实验室或检测机构检测能力的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的能力验证冷冻干燥样品。方法对目标菌与干扰菌进行10倍梯度稀释,对不同稀释度的菌液进行菌落计数得到菌含量,确定单核细胞增生李斯特氏菌与干扰菌的添加量;对保护剂和预冻条件进行筛选优化,制备单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品。冻干样品采用西林瓶真空包装,4℃条件下冷藏保存,随机取样检测评估样品均匀性,并在210 d期间内定期抽样检测不同贮存温度下的冻干样品,检测评估样品的稳定性。结果每个冷冻干燥阳性样品最终添加目标菌单增李斯特菌和干扰菌分别为10~2 CFU/m L和10~4 CFU/m L;每个阴性样品添加干扰菌10~4 CFU/m L;最佳冻干保护剂的组合为海藻糖3%,脱脂奶粉8%,谷氨酸钠1.5%。检测结果显示PT冻干样品具有较好的均匀性和稳定性。结论建立的单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品制备方法与评估程序均为有效,适用于验证与评价实验室或检查机构检测能力,满足能力验证活动的要求。     

单核细胞增生李斯特菌特异性单链抗体磁珠的制备与评价

目的:制备一种单核细胞增生李斯特菌的特异性单链抗体捕获磁珠(scFv-IMBs),通过用人工污染的方式评价scFvIMBs的效果。方法:在不同的增菌培养体系中以市售磁珠(Dyna-IMBs)作为对照,通过定性、定量培养技术和PCR检测技术,分析scFv-IMBs在法兰克福香肠中捕获与分离单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌的能力。结果:在BHI培养基中,scFv-IMBs对单核细胞增生李斯特菌的捕获率介于15%～55%之间,优于Dyna-IMBs(0.85%～1.27%),显示出良好的特异性。在MOPS-BLEB培养基中两种磁珠的捕获率在62%～88%,捕获率高于在UVM培养基(5%)和FB培养基(53%)中。人工污染样品经scFv-IMBs捕获,单核细胞增生李斯特菌的菌落数在选择性培养基上的比例有显著性提升(P0.01),可从高浓度英诺克李斯特菌(1∶1 000)中有效分离单核细胞增生李斯特菌。磁珠检测方法的灵敏度可达1 CFU/mL。结论:与市售免疫磁珠产品相比,scFv-IMBs具有较好的特异性,可显著降低体系中英诺克李斯特菌的干扰,具有更好的分离能力。     

数字PCR定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌方法的研究

目的建立微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的分析方法。方法选择基因hly A为靶序列,设计PCR扩增引物和Taq Man探针,优化反应条件和反应体系,通过细菌分离和dd PCR方法对靶标基因的检测特异性、灵敏度和重复性进行实验,并对定量结果进行分析。结果 ddPCR反应中的最佳探针浓度为5 pmol/μL,特异性好,检出限为(3.6±0.1)copies/20μL,重复性实验良好,标准偏差为0.067%。ddPCR的拷贝数(copy number)与细菌密度(colony forming units,CFU/mL)形成了较好的线性关系。结论本研究建立dd PCR的拷贝数和菌液密度或菌落数的线性关系,可以为单核细胞增生李斯特氏菌的快速定量检测提供参考。     

纳米氧化镁对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用

研究37℃条件下不同浓度纳米和非纳米氧化镁对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用,以及低温(4和-18℃)对纳米氧化镁抑菌作用的影响,并通过扫描电子显微镜(SEM)观察了37℃条件下纳米氧化镁处理前后单核细胞增生李斯特菌细胞形态的变化。结果表明,37℃条件下,纳米氧化镁对单核细胞增生李斯特菌的生长具有明显的抑制作用,且抑菌效果随着纳米氧化镁浓度的增加而增大。在中性缓冲溶液中纳米氧化镁仍具有抑菌效果,但同浓度的非纳米氧化镁以及与纳米氧化镁同pH的碱性条件对单核细胞增生李斯特菌均无显著的抑制作用,因而推测纳米氧化镁的纳米材料特性是其抑菌的主要因素。在低温条件下,对照组单核细胞增生李斯特菌在4℃条件下能缓慢生长,-18℃条件下呈现下降趋势,添加纳米氧化镁后单核细胞增生李斯特菌的生长均受到显著抑制。37℃条件下的扫描电镜结果显示,1.5 mg/m L纳米氧化镁处理后单核细胞增生李斯特菌的菌体有所变长。     

台州市食源性单核细胞增生李斯特菌分子特征研究

目的了解台州市食品中分离的单核细胞增生李斯特菌的血清型、毒力基因以及基因分型情况,建立食源性单核细胞增生李斯特菌的分子特征本底信息,为食源性疾病的防治提供技术支持。方法对近几年从食品中分离的37株单核细胞增生李斯特菌进行多重PCR血清分型、9种毒力基因(prf A、inl A、inl B、iap、fla A、hly A、plc B、mpl和act A)PCR检测、PFGE基因分型,用Bio Numerics 6.6软件对分型数据进行聚类分析。结果 37株食源性单核细胞增生李斯特菌的血清型以1/2a或3a型别为主;所有菌株均检出4种以上毒力基因,有15株菌携带所有9种毒力基因;37株菌经Apa I酶切PFGE分型后,共得到22种带型,每种带型包含1~5株不等,相似度区间为67%~100%。结论台州市食源性单核细胞增生李斯特菌存在致病流行风险,建立的指纹图谱数据库可为食源性疾病的防治提供技术支持。     

水产品中单核细胞增生李斯特氏菌检验研究

本文是对水产品中单核细胞增生李斯特氏菌常规检验的研究。结合国家标准、行业标准和FDA《细菌学检验手册》第八版中所述方法进行检验。自朝鲜进境的水产品23类、255批中检出李斯特氏菌7株。结果表明,由于食品加工过程对微生物损害极大,使大多数微生物处于濒死状态,因而加速受损细胞恢复是单核细胞增生李斯特氏菌检验前增菌的关键。在检验过程中最初分离时发现了可疑菌落并就此进行确认和得出结论,而不是延长增菌时间继续分离和鉴定,容易产生假阴性结果。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的风险评估

微生物风险评估主要评估食品中的微生物性病原可能对人群引起的潜在危害,以指导风险管理者制定相应的管理措施。单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌,由于该菌引发的疾病致死率较高,且其暴发常出现于工业加工食品中而引起了世界范围内的广泛关注。JEMRA及美国FDA/FSIS分别对即食食品中单核细胞增生李斯特氏菌进行了定量评估并发布了完整的评估报告。各国也有对本国特定食品中单核细胞增生李斯特氏菌进行评估的文献报道。但在数据不足的情况下,也可通过定性/半定量的风险分级工具对不同来源的风险进行分级,并确定优先性。由于各国人群消费模式、消费量的不同,以及食品制作和处理方法上的差异会对暴露评估的结果产生影响,从而影响每份食品风险的大小,因此,各国有必要根据本国的情况对特定食品中的单核细胞增生李斯特氏菌进行相应的评估。     

酵母菌促进单核细胞增生李斯特氏菌的生长

为了缩短单核细胞增生李斯特氏菌(单增李斯特氏菌)的前增菌时间,提升检测效率,本研究将酵母菌(ATCC9763)作为一种生长促进剂加入到单核细胞增生李斯特氏菌的前增菌培养基(LB1)中,结果表明添加适量的酵母菌可以使单增生李斯特氏菌的生长速度提升近100%,并且这种促进作用与培养过程中酵母菌的接种量、培养基的溶氧量以及培养方式密切相关。根据酵母菌的生长特性分析,这种促进作用产生的原因很有可能是由于酵母菌在生长过程中发酵分解了培养基中的糖类等营养物质,改善了单增李斯特氏菌的营养条件,从而提高了单增李斯特氏菌的繁殖速度。本研究为缩短单增李斯特氏菌检测的富集培养时间,提高检测效率奠定了很好的基础,同时也侧面提示我们要关注发酵类食品遭受单增李斯特氏菌污染的食品安全风险。