牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的一基因片段的克隆、表达、纯化及抗原性鉴定

目的 克隆并表达牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的一基因片段,并检测其杭原性.方法 利用RT-PCR技术克隆β-LG蛋白基因片段,测序后将目的片段克隆入原核表达质粗pET载体,转化至大肠杆菌origami,经IPTG诱导表达,获得重组β-LG片段蛋白.用Nit~2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELLSA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性.结果 克隆获得β-LG片段蛋白,其开放阅读框基因为264 by(含终止密码子),编码87个氨基酸.获得的重组β-LG片段蛋白既以包涵体形式存在又以可溶性形式存在,用可溶性的蛋白进行纯化,经Western blot和ELISA检测具有较好的抗原性.结论 成功地克隆和表达了β-LG的--基因片段,为后续牛奶的免疫原性研究提供参考,也为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体和制备其主要过敏原的检测试剂奠定了基础.     

花生Ara h6基因的克隆、表达以及免疫活性鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Arah6基因,诱导表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Arah6的基因,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-28a上,并转入BL21（DE3）宿主表达菌中,IPTG诱导表达,通过Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白,Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明花生Arah6目的片段全长为438bp,编码145个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同。该基因诱导表达的产物纯化后经SDS-PAGE鉴定为17kDa。Western-blotting结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性。结论:成功克隆花生过敏原Arah6的基因,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。      

甜荞麦16 kDa过敏原基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 对甜荞麦(common buckwheat)过敏原的分子生物学开展研究。方法 通过RT-PCR克隆甜荞麦16 kDa过敏原蛋白的全长基因, 并根据序列设计带有酶切位点的特异性引物, 扩增甜荞麦16 kDa过敏原基因的完整开放阅读框, 与pET-28a载体连接, 构建原核表达载体。 结果 本研究成功克隆了甜荞麦16 kDa过敏原蛋白的基因, 且构建了其原核表达载体。该基因含有长度为450 bp的开放阅读框, 编码149个氨基酸, 在GenBank数据库中的登录号为EU883600, 同源性分析发现其与数据库中已知的荞麦过敏原基因有高度的同源性。结论 本研究为甜荞麦16 kDa过敏原蛋白的重组表达和临床过敏性疾病的诊断奠定了基础。     

禽蛋黄过敏原Gal d 6的重组表达、纯化鉴定

目的:建立表达蛋黄Gal d 6 重组蛋白工程菌,并鉴定重组Gal d6蛋白免疫活性。方法:直接合成Gal d 6 DNA,与pET-28a构建重组质粒,转化E.coli BL21经IPTG诱导表达;优化表达条件制备重组Gal d 6蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到纯品蛋白;纯化Gal d6蛋白经间接ELISA及western blot鉴定Gal d 6蛋白免疫活性。结果:经DNA测序、SDS-PAGE、禽蛋过敏血清鉴定表达Gal d 6蛋白具有免疫活性,经镍柱亲和层析获得单一条带。该工程菌最佳表达条件为37 ℃,0.5 mmol/L IPTG,2 h,收获量每升菌液可收获重组蛋白约9.1 mg。重组蛋白与禽蛋过敏血清具有良好反应性。结论:建立稳定表达具有免疫活性的Gal d 6蛋白的工程菌株。     

大黄鱼类IV型抗冻蛋白基因的克隆、表达及功能研究

目的 研究大黄鱼类IV型抗冻蛋白基因编码产物的功能.方法 从大黄鱼肝脏SSH cDNA文库筛选到的类似极地鱼类IV型抗冻蛋白的EST序列出发,用RACE方法克隆IV型抗冻蛋白基凶全长cDNA,RT-PCR分析此基因在大黄鱼不同组织内的表达.构建原核表达载体pGEX-4T-Lycarp并表达蛋白质,亲和层析纯化GST融合蛋白,分析它的体外细菌抗冻保护作用.结果 大黄鱼类IV型抗冻蛋白基因cDNA全长664 bp,包含372 bp开放阅读框,编码124个氨基酸,经Signal P 3.0软件预测其N端前20位氨基酸为信号肽,氨基酸序列与长角杜夫鱼IV型抗冻蛋白同源性高达52%:RT-PCR分析表明其mRNA仅在肝脏表达;重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,初步纯化后分析体外细菌抗冻保护作用表明,融合蛋白抗冻活性并不明显.结论 大黄鱼类IV型抗冻蛋白不具有显著的抗冻活性,这与大黄鱼不能在低温下生存吻合.     

大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白基因的克隆、表达及功能研究

目的研究大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白基因编码产物的功能。方法从大黄鱼肝脏SSHcDNA文库筛选到的类似极地鱼类Ⅳ型抗冻蛋白的EST序列出发,用RACE方法克隆Ⅳ型抗冻蛋白基因全长cDNA,RT-PCR分析此基因在大黄鱼不同组织内的表达。构建原核表达载体pGEX-4T-Lycafp并表达蛋白质,亲和层析纯化GST融合蛋白,分析它的体外细菌抗冻保护作用。结果大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白基因cDNA全长664bp,包含372bp开放阅读框,编码124个氨基酸,经SignalP3.0软件预测其N端前20位氨基酸为信号肽,氨基酸序列与长角杜夫鱼Ⅳ型抗冻蛋白同源性高达52%;RT-PCR分析表明其mRNA仅在肝脏表达;重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,初步纯化后分析体外细菌抗冻保护作用表明,融合蛋白抗冻活性并不明显。结论大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白不具有显著的抗冻活性,这与大黄鱼不能在低温下生存吻合。     

大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白基因的克隆、表达及功能研究

目的研究大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白基因编码产物的功能。方法从大黄鱼肝脏SSHcDNA文库筛选到的类似极地鱼类Ⅳ型抗冻蛋白的EST序列出发,用RACE方法克隆Ⅳ型抗冻蛋白基因全长cDNA,RT-PCR分析此基因在大黄鱼不同组织内的表达。构建原核表达载体pGEX-4T-Lycafp并表达蛋白质,亲和层析纯化GST融合蛋白,分析它的体外细菌抗冻保护作用。结果大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白基因cDNA全长664bp,包含372bp开放阅读框,编码124个氨基酸,经SignalP3.0软件预测其N端前20位氨基酸为信号肽,氨基酸序列与长角杜夫鱼Ⅳ型抗冻蛋白同源性高达52%;RT-PCR分析表明其mRNA仅在肝脏表达;重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,初步纯化后分析体外细菌抗冻保护作用表明,融合蛋白抗冻活性并不明显。结论大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白不具有显著的抗冻活性,这与大黄鱼不能在低温下生存吻合。     

重组花生过敏原Ara h 2生物合成

为获得重组花生过敏原Ara h 2。通过RT-PCR 合成cDNA,并以此为模板进行PCR 扩增目的基因Ara h 2,扩增产物经纯化后克隆至pMD19-T Simple 载体中,构建重组质粒pMD19-T-Ara h 2。上述重组质粒经酶切纯化后定向克隆到pGEX-4T-1 表达载体中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-Ara h 2,并转化表达宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL 中,经IPTG 诱导表达。SDS-PAGE 电泳结果表明,该表达蛋白大小约为46kD,与理论值相符。通过Glutathione Sepharose 4B 凝胶亲和层析方法纯化融合蛋白GST-Ara h 2,获得融合蛋白纯度约为90%。Western blotting 分析表明,经纯化的融合蛋白能与抗Ara h 2 兔血清发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。     

芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达

为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总RNA,逆转录合成cDNA,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins基因的完整开放阅读框,并与pET-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）及用IPTG诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白Oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框（包括终止密码子）,编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kDa,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白Oleosins基因同源性很高（GenBank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为EU999158和EU999159）,并在DE3中高效表达。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。