一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。     

栖热袍菌α-葡糖苷酶的基因克隆表达及酶学性质

用分子克隆手段获得栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)中的α-葡糖苷酶基因,构建该基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。以Thermotoga neapolitana DSM 4359的α-葡糖苷酶基因DNA为模板,通过PCR扩增目的基因,并连接至表达载体中,构建重组质粒pET-28a-glu,然后转化到大肠杆菌中,加IPTG诱导获得重组蛋白。提取粗酶,用葡萄糖测定试剂盒测酶活。序列分析结果表明,该基因的读码框碱基长度为2166bp,编码722个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明,α-葡糖苷酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,蛋白分子量约为62KDa;酶的最适反应温度为70℃,最适pH为5.0。     

绿色木霉葡聚糖内切酶(EGⅠ)基因克隆及在酿酒酵母中的表达

以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目的基因在酿酒酵母Fm135a中成功表达,所得葡聚糖内切酶经初步纯化后,SDS-PAGE检测为49 kD,比活力为2.45 U/mg。     

串珠镰孢菌来源的角质酶基因的克隆表达及其酶学性质

克隆一个来源于串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme Sheld)的角质酶基因,该基因全长693 bp,编码231个成熟的氨基酸。克隆的角质酶基因构建到pPIC9K质粒,获得重组表达载体,转入毕赤酵母(Pichia pastoris Gs115)中进行高效表达。经甲醇诱导96 h,测得重组酶酶活为71.68 U/mL,经纯化获得比活力为2490.1 U/mg。对纯化后的角质酶进行酶学性质分析结果表明,其最适反应pH为9.0,在pH5.0~9.0范围内之间重组角质酶的酶活相对稳定;最适反应温度为35 ℃,在40 ℃条件下保温1 h酶活力保持70%以上。KCl、Triton X-100、MnCl₂、SDS对该酶活有促进作用,NaCl、BaCl₂、CuSO₄、Tween-20、FeSO₄、ZnSO₄、NiCl₂、EDTA、Tween-80对该酶活有抑制作用。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。     

有机磷农药降解酶基因Oph2的克隆及甲基对硫磷降解效果研究

摘要：目的 挖掘可高效表达农残降解酶的基因,并构建含有该表达基因的工程菌,以此提供一种高效去除有机磷农残的新方法。方法 利用基因克隆获得高效表达农残降解酶基因Oph2,采用基因工程手段将其转化至毕赤酵母表达系统,对毕赤酵母的发酵产物进行SDS-PAGE定性研究和酶活定量研究,最后通过与目标底物甲基对硫磷反应,分析工程菌表达降解酶对有机磷农残的去除效果。结果 本研究成功克隆得到了高效表达有机磷降解酶基因Oph2,基因全长1000bp,编码256个氨基酸,酶蛋白分子量为37KD,并利用表达载体pPIC9K成功将其转化至毕赤酵母GS115。构建的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2表达有机磷降解酶活性为11.57 U/mL,对6.8 mg/L的甲基对硫磷降解效率为90%以上。结论 本研究得到的工程菌GS115-pPIC9K-Oph2可高效表达有机磷降解酶,该酶活性高,对有机磷农残降解能力强,可有效应用于有机磷农残的降解。     

中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05 α-淀粉酶基因的克隆和原核表达

本实验室从新疆盐湖分离得到一株产α-淀粉酶中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05,根据已报道的α-淀粉酶基因(α-AMY)序列的保守区域设计引物,从中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05基因组中扩增出α-淀粉酶基因片段,将α-淀粉酶基因纯化后克隆到pGM-T载体上测序,结果表明α-淀粉酶基因片段长约1500bp,与地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的α-淀粉酶基因序列的同源性为95%,两种序列具有一定的同源性。按正确的阅读框架将α-淀粉酶基因片段定向克隆到表达载体pET-32a上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,α-淀粉酶基因能在大肠杆菌BL21中成功表达,确定表达蛋白的相对分子量为61kD左右,与理论推导的分子量相一致;构建的大肠杆菌工程菌,所产生的α-淀粉酶是包涵体,通过超声波粉碎仪粉碎后,测α-淀粉酶酶活为原菌的1.8倍。     

黑曲霉木聚糖酶（xynZF-2）基因克隆、表达及酶学性质分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉（Aspergillusniger）XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因（xynZF-2）的cDNA序列（Genbank登录号为：JQ700382）。该基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,其中成熟肽为107个氨基酸。以重组质粒pUCm-T—xynZF-2为模板,扩增得到编码xynZF－2成熟肽的cDNA片段（624bp）。将其与表达载体pET－28a连接,构建重组表达载体pET－28a—xynZF－2,并转化大肠杆菌（Escherichiacoh）BL21（DE3）,获得重组工程菌BL21／xynZF-2。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的的比酶活最高可达42．33U／mg。重组表达的木聚糖酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,在碱性条件下具有良好的稳定性。Fe^3＋对酶的激活作用最为明显。     

耐热纤维素酶在大肠杆菌中的高效表达及酶学特性分析

将来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum ATCC 27405)的编码内切β-1,4-葡聚糖酶的结构基因(celD)分别插入到pHsh和pET两个表达系统,分别得到质粒pHsh-celD和pET-20b-celD。将重组质粒转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达,在pET系统表达时形成包涵体,采用热激表达系统pHsh在大肠杆菌表达时实现了纤维素酶的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子质量为66kD,与理论值相符。纯化的纤维素酶的最适反应pH为5.4,在特性不同的pH条件下60℃保温30 min,重组纤维素酶在5.4~7.8的pH范围内比较稳定,在75℃下酶的半衰期约为1 h,Ca2+可以增强酶活,而EDTA则会抑制酶的活性。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好,这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达及重组酶性质研究

为实现对魔芋葡甘聚糖具有高度专一性的β-甘露聚糖酶基因的异源表达,从枯草芽孢杆菌G1中克隆出β-甘露聚糖酶基因BsmanA,将该基因与表达载体pACYCDuet-1连接并转化到E.coil BL21(DE3)中。结果表明:该β-甘露聚糖酶基因BsmanA序列全长为1098 bp,编码366个氨基酸;经Ni柱亲和层析纯化后,测得重组酶分子量大小为38 kD;酶学性质研究结果显示:该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.5,在温度50~70℃间,pH4.5~7.0的范围内能保持较好的稳定性。本研究实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,为生物催化制备低聚甘露糖的工业化提供了新的选择。     

小麦蛋白质二硫键异构酶基因的克隆、表达及重组酶性质

目的:克隆小麦蛋白质二硫键异构酶(wheat protein disulfide isomerase,wPDI)基因,实现其在大肠杆菌中的表达并探究其酶学性质。方法:以小麦种子总RNA为模板,逆转录并扩增得到wpdi,并以pET-30b为表达载体、大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌进行原核表达,表达产物经金属螯合层析纯化后进行了酶学性质研究。结果:克隆的基因全长1 548 bp,与"Wyuna"品种小麦wpdi基因相似性达99%。构建了pET-30b-wpdi表达载体,获得w PDI的最佳表达条件为:诱导温度22℃,诱导时间6 h,诱导剂浓度0.5 mmol/L。该酶含4个硫氧还蛋白结构域,分子质量约为66.2 kD,具有二硫键的还原酶和异构酶活性以及分子伴侣活性。结论:对重组wPDI的表达和酶学性质研究,为wPDI在面制品加工及其他方面的应用提供参考依据。     

异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

以pET-30(a)为表达载体,将来源于枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)的异甘露聚糖酶基因(isoman K-6)在Escherichia coli BL21(DE3)中进行了表达。Isoman K-6登录号为HQ902141,基因全长为1083bp,共编码360个氨基酸,工程菌酶活为415.9U/mL,SDS-PAGE电泳表明,工程酶ISOMAN K-6分子量约为45000u,与预期分子量相符。经IDAHisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质研究表明,该重组酶为金属酶,Al3+和Ba2+对其有很强的激活作用,其最适反应温度为55℃、最适pH为6.0,且在pH4.5~7之间有着较好的稳定性,以槐豆胶为底物时,Vmax和Km分别为1.3U/mL和7.3mg/mL。     

传统食品发酵环境宏基因组中酯酶基因的克隆、表达及性质分析

微生物酯酶是一种广泛应用于食品、医药和精细化工等领域的工业化酶。为了丰富酯酶资源,本文通过提取我国传统发酵食品环境样品总基因组DNA,构建宏基因组文库,从中筛选获得一个新的酯酶基因(est_115),该基因全长948 bp,编码316个氨基酸,其蛋白序列同源性分析,表明与来自Pseudomonas lutea的羧酸酯水解酶同源性最高为38%,显示酯酶Est_115属于新的酯酶类。然后构建了est_115基因重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,经纯化得到重组酯酶Est_115。酶学性质的分析表明,该重组酯酶Est_115对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯具有较高的催化活性,最适作用温度为35℃,最适p H值为7.0,在10%~18%Na Cl条件下,酶蛋白可保持较高的催化活性,具有良好的耐盐性,提示该酶可以应用在高渗透压食品加工中,是一个新型的极具潜力的酯酶。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

鞘氨醇单胞菌属菊粉酶基因lev的克隆、表达及酶学性质的研究

基于454高通量测序细菌JB13全基因组,获得一个编码菊粉酶的基因lev,该基因全长为1518bp,编码505个氨基酸组成的多肽,成熟蛋白的理论分子量为55.70ku。将基因lev克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物具有菊粉酶活性,并初步研究了该酶的酶学性质。结果表明:酶作用的最适pH为5.5,最适温度为50℃,该研究为鞘氨醇单胞菌属来源菊粉酶的首次报道。     

罗伊氏乳杆菌果聚糖蔗糖酶基因的克隆与表达

以罗伊氏乳杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆获得果聚糖蔗糖酶基因lev。生物信息学分析表明:该基因全长1 776 bp,编码一个含591个氨基酸残基的多肽。该多肽的预测分子质量为65.47 ku,等电点为4.74,二级结构主要有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成。克隆所得的lev基因与Gen Bank注册的罗伊氏乳杆菌lev基因(注册号:EF534264.1)的核苷酸序列同源性为97.97%。本研究所得lev基因经构建表达载体在大肠杆菌BL21中表达,重组酶具有果聚糖蔗糖酶的活性。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表达及其降解毒素初步研究

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌属产生的次生代谢物,是极易污染粮食作物的真菌毒素之一。ZEN具有强烈的雌激素样效应及致癌性,给人类和动物的健康造成巨大威胁。本研究在NCBI数据库中进行同源比对,获得了一些ZHD101降解酶的同源基因,其中,1个来源于真菌——杨盘二孢菌(Marssonina brunnea)的蛋白序列与ZHD101具有32%的同源性,基因大小为861 bp。通过化学合成方法得到该全长基因,通过构建E.coli原核表达系统进行蛋白表达,蛋白经亲和色谱纯化后对ZEN分子进行降解活性验证,HPLC结果表明,该蛋白在6 h内对10μg ZEN分子的降解率为98%,酶活为200 U/m L,从而获得了1个新的ZEN降解酶基因。     

生物质降解菌系中GH11家族耐热木聚糖酶基因的克隆与鉴定

以玉米芯粉为基质富集培养牛粪中生物质降解菌系,提取该降解菌系的宏基因组DNA,并以其为模板,通过简并引物PCR扩增出200bp左右的木聚糖酶基因片段,选择与耐热木聚糖酶相似性最高且丰度最高的基因序列,应用mTAIL-PCR扩增得到1 059bp的基因全长序列(xynHAD4),编码352个氨基酸,经序列比对分析,该木聚糖酶(XynHAD4)属于典型的GH11家族木聚糖酶,与来源于Dictyoglomus thermophilum的xylanase229B相似度为93%。将xynHAD4连接于表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中成功得到表达,表达产物经纯化后,测定其分子质量约为36kDa,最适作用温度和pH分别为80℃和6.0,该酶在90℃保温1h,残余酶活为72%,pH作用范围较广,在pH4.0保存1h,残余酶活为82%,可见,XynHAD4属于耐热木聚糖酶,并且在酸性条件下可保持较高稳定性,在食品、饲料等领域具有潜在的应用价值。     

红曲菌Mn-SOD基因克隆、表达及序列分析

为得到产Mn-SOD工程菌及表达产物,通过设计出红曲菌H4000 Mn-SOD简并引物得到目的基因片段,再设计全长引物利用PCR技术扩增红曲霉Mn-SOD基因的全长序列。经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后连接至相同酶切的表达载体pET28a,并转化至E.coli BL21进行诱导表达。克隆得到的基因预测编码152个氨基酸,预测相对分子量为17 kDa。同时,将克隆得到的Mn-SOD基因与NCBI数据库进行比对,发现该序列与橙色红曲霉超氧化物歧化酶(SOD)基因相似度达到99%,与炭疽菌、米曲霉、黄曲霉的Mn-SOD基因也有较高的相似度。通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,目标蛋白相对分子质量约为19 kDa,与预测分子量基本相符。该表达蛋白在pH2.0保温处理1 h,仍具有较高的Mn-SOD酶活。