产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR的方法从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) 中扩增出3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因及侧翼序列 CgGPD1,分别构建了含不同 CgGPD1 拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1(Ⅰ)、pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1(Ⅱ)和pCAM3300-zeocin-CgGPD1 -CgGPD1-CgGPD1(Ⅲ).在大肠杆菌JM109中,研究了其在不同质量浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况.结果表明,在大肠杆菌中GPDH的活性随着NaCl、葡萄糖质量浓度的升高而增加.当NaCl质量浓度达到2.5 g/dL时,GPDH的酶活比在0.5 g/dL NaCl下平均提高31.2%; 当葡萄糖质量浓度提高至10 g/dL时,GPDH的酶活比2 g/dL葡萄糖下平均提高31.8%;在相同的NaCl、葡萄糖质量浓度下,GPDH的活性随着 CgGPD1 拷贝数的增加而升高,JM109(Ⅱ)比JM109(Ⅰ)的GPDH酶活平均提高8.2%,JM109(Ⅲ)比JM109(Ⅱ)的GPDH酶活平均提高9.9%.以上结果表明,在大肠杆菌中 CgGPD1 基因的表达同样受渗透压胁迫调节.     

产甘油假丝酵母胞浆3磷酸甘油脱氢酶在甘油形成中的作用

为了研究胞浆３磷酸甘油脱氢酶（ｃｔＧＰＤ, ＥＣ １．１．１．８）在产甘油假丝酵母（ ＣａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｇｅｎｅｓｉｓＺｈｕｇｅ ）甘油合成机制中的作用,考察了发酵实验过程中ｃｔＧＰＤ的活力水平以及高渗环境对该酶酶活水平和甘油形成的影响．结果表明,该菌种中,ｃｔＧＰＤ 的表达在相对低渗的发酵过程中处于一个较高的水平,并在３６ ｈ 和６０ ｈ 处分别出现两次峰值;高渗环境可使ｃｔＧＰＤ酶活增加,但幅度不大．发酵试验表明,随着高渗溶质浓度增大,可在一定程度上恢复细胞产甘油能力,但总水平下降．     

优化简并引物PCR克隆Candida glycerinogenes 3-磷酸甘油脱氢酶基因片段

为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因(ctGPD),对不同酵母和其他真核生物的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.glycerinogenes的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)基因片段,经过优化PCR反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出CgGPI)基因中约600 bp的保守核心片段.DNA序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPI)基因相似性较高.     

产甘油假丝酵母两种转化方法的比较

为了研究产甘油假丝酵母高产甘油和耐高渗的机制,以Zeocin作为选择标记,考察和比较了两种转化方法,即醋酸锂法和电转化法的转化效果,以建立简单有效的产甘油假丝酵母转化体系。结果表明,细胞生长时期是影响转化率的关键因素。在OD600约为1.3时制备感受态细胞,在电压为1.5 kV时进行电击,可获得较高转化率,为每微克DNA 139个转化子。在OD600约为1.0时制备感受态细胞,醋酸锂预处理细胞1 h,获得的转化率为每微克DNA 154个转化子。综合考虑,醋酸锂法更适合于产甘油假丝酵母的转化。     

产甘油假丝酵母酸性磷酸酯酶突变株的选育及其性质研究

运用化学诱变法从高产甘油的工业生产菌株产甘油假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｏｌｇｅｎｅｓｉｓ）ＷＬ２００２－５（Ｈ－）筛选获得两类酸性磷酸酯酶突变株．一类为阻遏型酸性磷酸酯酶缺失突变株;另一类为对磷调节不敏感的部分去阻遏调节突变株,并研究了它们的发酵性能     

产甘油假丝酵母稳定期酸胁迫耐受性研究

研究了产甘油假丝酵母稳定期的酸胁迫耐受性。结果表明,在一定的酸性pH值范围内,pH值降低而酸胁迫压力增加,可以促进产甘油假丝酵母胞内聚磷酸盐积累,从而保证细胞免受酸胁迫的过度影响,维持较高甘油生产水平所需的活细胞数;但过高的酸性环境会严重损伤细胞,降低细胞合成聚磷酸盐的能力,从而使细胞存活率和甘油产量下降。产甘油假丝酵母胞内积累聚磷酸盐,可以增强其对营养饥饿和强酸胁迫等的抵抗力,从而提高其在生长稳定期的存活率。     

高渗工业菌株Candida glycerinogenes整合型表达载体的构建及验证

构建应用于工业用产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CGMCC NO.6830的整合型表达载体,建立一种可利用底物形成的渗透压调控表达外源基因的体系。以p UC19质粒为基本骨架,C.glycerinogenes CGMCC NO.6830的18S r DNA为整合位点,运用其3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PCggpd启动外源基因表达,腐草霉素抗性基因ble作为重组酵母转化子筛选标记,获得应用于产甘油假丝酵母的稳定的表达型整合载体;以绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因考察该表达质粒的性能,实现了外源基因gfp的渗透压调控表达。     

高强度产甘油假丝酵母突变株的选育及其发酵性状

以一株产甘油假丝酵母为出发菌株 ,采用化学诱变 ,通过玉米浆和外加无机磷组成的磷质量浓度为 3 40mg/L的磷源选择培养基 ,得到了一株发酵时间较原菌株缩短了 8h左右 ,产甘油能力 (甘油产量约为 1 40 g/L ,甘油转化率为 5 6% )和原菌株相似的突变株 ,并研究了突变株的发酵性状 .     

产甘油假丝酵母在丙三醇发酵过程中的有机酸种类及其变化

HPLC分析研究了产甘油假丝酵母 (Candidaglycerolgenesis)发酵过程中有机酸的种类和含量变化 .C .glycerolgenesis主要在菌体生长期产生有机酸 ,使发酵液总酸增加 .确定了发酵过程形成的有机酸含有乙酸、乳酸、丙酮酸、酮戊二酸、苹果酸等 .建立了HPLC测定有机酸的方法 .分析发现 :有机酸中乙酸质量浓度最高约为 1.6 g/L .随着发酵时间的延长 ,发酵液总酸含量逐渐下降 ,而乙酸和α -酮戊二酸在发酵后期有所回升 .     

利用芭蕉芋葡萄糖浆发酵生产甘油

研究确定了利用双酶法水解获得的粗芭蕉芋葡萄糖浆生产甘油的最适条件:葡萄糖浓度22%~23%,尿素1.5g/L,玉米浆1.0g/L,摇床转速120r/min;糖化液pH值是否调整对甘油产量影响不大;摇瓶发酵甘油浓度可达110g/L,耗糖转化率达48%。与以工业葡萄糖为碳源的甘油发酵相比,以芭蕉芋糖化液为碳源的甘油发酵最适初始葡萄糖浓度稍低,外加营养需要量降低,发酵摇床转速提高。     

好氧发酵法生产甘油的转化率和生产强度

设计了小型玻璃连续发酵反应器，考察了甘油发酵的生产强度和转化率变化规律。结果表明：转化率随发酵时间的延长趋于一定值。对甘油发酵过程作碳源衡算，求得理论转化率ＹＰ＝１．５７；甘油浓度对发酵时间作图是一条“Ｓ”形曲线，生产强度随发酵时间有一峰值的变化。采用了高密发酵来提高发酵生产强度，结果表明：菌体浓度为１１％～１２％发酵液发酵６０ｈ甘油浓度达到１０８．９ｇ／Ｌ，生产强度为１．８１ｇ／（Ｌｈ），８０ｈ甘油浓度为１４２ｇ／Ｌ，生产强度为１．７７ｇ／（Ｌｈ）．发酵结束转化率达到５２％．     

高渗环境假丝酵母胞内甘油和海藻糖代谢研究

研究高渗环境中假丝酵母(T酵母)细胞内海藻糖和甘油的代谢情况。利用微波破碎法这一传统的物理破壁法来提取T酵母细胞内甘油和海藻糖,并通过高效液相色谱仪测定细胞内甘油和海藻糖的含量。经过高效液相色谱测定,可以得到不同盐浓度下T酵母胞内甘油和海藻糖含量。T酵母在高渗环境中通过对甘油和海藻糖的积累,同时阻止甘油的外排作用来抵抗外界环境对其生长的影响。     

产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析

从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子.插入片段全长2 456 bp,包含一段1 314 bp的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%.多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区.对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因.     

酵母菌合成酯类化合物关键酶基因的研究进展

酯类化合物是发酵食品的重要香气成分之一,酵母发酵是酯类化合物产生的主要来源。在分析酵母菌酯类生物合成途径的基础上,对合成途径中的关键酶基因,包括脂肪酶/酯酶基因、醇酰基转移酶基因和醇脱氢酶基因及其酶作用进展作了综述。      

酵母菌合成酯类化合物关键酶基因的研究进展

酯类化合物是发酵食品的重要香气成分之一,酵母发酵是酯类化合物产生的主要来源。在分析酵母菌酯类生物合成途径的基础上,对合成途径中的关键酶基因,包括脂肪酶/酯酶基因、醇酰基转移酶基因和醇脱氢酶基因及其酶作用进展作了综述。     

以产朊假丝酵母为原料生产风味酵母抽提物工艺的研究

以产朊假丝酵母为原料制备酵母抽提物,以氨基态氮含量和抽提物得率为主要指标考察了对酵母自溶影响关键的几个因素,包括均质压力、均质次数、自溶温度、自溶p H、外加蛋白酶的种类及添加量、自溶时间,并在此单因素实验基础上对酵母自溶进行正交实验,最后确定了酵母抽提物的最佳工艺条件为:15%浓度的酵母悬浮液,75MPa压力下循环均质2次后,调初始p H6.5,并添加1.5%(w/w)的复合风味酶,温度50℃下水浴自溶48h。在此最佳工艺条件下,制得的酵母抽提物的氨基态氮含量和得率分别达到650.6mg/100m L和50.1%,该酵母抽提物有酱香并略带酯香,口感浓郁有鲜甜味。     

野生酵母的耐性研究和菌种鉴定

菌株3和621是本实验室筛选得到能发酵木糖产生酒精的野生酵母菌,具有较好的耐高渗透压生长特性,实验表明菌株3可以耐受12％的NaCl、6％的乙醇和58％的葡萄糖;菌株621可以耐受16％的NaCl、4％的乙醇和61％的葡萄糖。经过18S rDNA同源性分析,菌株3鉴定为间型假丝酵母（Candida intetmedia）,而菌株621则为热带假丝酵母（Canada tropicalis）。     

提高产朊假丝酵母富硒能力的工艺条件研究

在5L发酵罐水平上研究不同培养条件对富硒产朊假丝酵母细胞生长、谷胱甘肽合成和富硒能力的影响,通过分批发酵试验确定较优的培养方案:在发酵培养的第18小时加入20mg/L亚硒酸钠,发酵罐转速450r/min,L-蛋氨酸的添加浓度10mmol/L.该条件下,酵母细胞干重为11.32g/L,胞内谷胱甘肽和有机硒含量分别达到11.5mg/g和1352μg/g,该方案为高性能(高胞内谷胱甘肽含量、高有机硒含量)富硒产朊假丝酵母的高效制备奠定了基础.     

产朊假丝酵母发酵培养基的优化研究

对产朊假丝酵母高产菌体量的液体发酵培养基进行了研究,结果表明其优化后的培养基为:葡萄糖40g/L,蛋白胨10g/L,KH2PO42g/L,MgSO4·7H2O0.3g/L。摇瓶发酵结果菌体干重达到6.37g/L,比基础培养基发酵结果增加了47%。     

产朊假丝酵母利用有机酸的研究

在有机酸为唯一碳源的培养中培养产朊假丝酵母(Candida utilis)时,以L-苹果酸、乳酸、琥珀酸或柠檬酸为碳源的培养基经过48h后,有机酸浓度均由初始浓度5.0g/L下降到0.0g/L。以乙酸、草酸和富马酸为碳源的培养基有机酸浓度始终没有明显变化,说明产朊假丝酵母能够利用细胞外的L-苹果酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸,不能利用乙酸、草酸和富马酸。当葡萄糖和L-苹果酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸中的某种有机酸共同做碳源时,葡萄糖浓度均可以在32h内从20.0g/L降到0.0g/L,而各有机酸在0~24h内浓度变化不大,24~48h浓度均有不同程度的下降,说明当培养基中有葡萄糖时,有机酸的利用受到抑制。当浓度均为2g/L的L-苹果酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸同时做碳源培养产朊假丝酵母时,乳酸大约经过40h浓度首先降到0.0g/L,L-苹果酸、柠檬酸、琥珀酸浓度在0~16h过程中没有明显变化,16~48h下降趋势明显,最后也都被菌体完全利用,说明乳酸比较容易被菌体利用,而L-苹果酸、琥珀酸和柠檬酸在被菌体利用先后顺序上没有明显区别。