人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的cDNA 5′末端的快速扩增

根据人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的CDS区已知序列设计引物,应用"去帽法"原理快速扩增出了人参皂苷-α-鼠李糖苷酶cDNA 5′端未知序列.测序结果表明,扩增出的5′端未知序列长度为421 bp.通过与已知的CDS区序列比对,确定扩增出的5′端未知序列就是目的序列,其5′端非编码区长度为61 bp.     

真菌产人参皂苷葡萄糖苷酶基因的调取

根据已知的人参皂苷糖苷酶(GluGF)的N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidia Sp.R84g菌株的总RNA出发,应用RACE技术,快速扩增测序得到cDNA3′末端与cDNA5′末端的未知序列,利用扩增测序所得到的cDNA5′末端和cDNA3′末端的序列设计引物,进行二次RT-PCR扩增并测序得到GluGF基因的全序列。回收PCR产物测序,得到GluGF基因的序列全长为2149 bp,其中5′UTR长度为82 bp,3′UTR长度为114 bp,GluGF的CDS区序列全长为1 923 bp,所编码的氨基酸序列的长度为640个氨基酸。     

RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA 3'末端的序列进行了调取.根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3'RACE(Rapid-Amplification of eDNA 3'Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3'端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp.这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3'末端的序列的调取提供了参考.     

RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的序列进行了调取。根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3′RACE(Rapid-Amplification of cDNA 3′Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3′端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp。这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3′末端的序列的调取提供了参考。     

两种菌产两种不同天然苷类α-鼠李糖苷酶的研究

采用TLC法和分光光度计法研究了Absidia sp．G3g产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶（RhaG）和Absidia sp．R9g产芦丁-α-鼠李糖苷酶（RhaR）的酶反应特性。实验结果表明,RhaG只水解人参皂苷Re的C-6位末端上的一个α-鼠李糖基,而RhaR能水解芦丁、橙皮苷、柚皮苷的α-鼠李糖基。两种酶反应条件中相同之处是酶反应最适底物质量浓度为1.0g／mL、最佳反应pH5．0,不同之处是RhaG反应的最佳反应温度是50℃,而RhaR则为40℃。     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的亚克隆及表达

将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。结果显示,重组酵母菌在甲醇体积分数为0.5%,72 h培养后,所提取的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其分子质量为52 ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。     

人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的亚克隆及表达

将人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因。结果显示,重组酵母菌在甲醇体积分数为0.5%,72 h培养后,所提取的酶蛋白经酶活性检测,发现具有人参皂苷-α-鼠李糖苷酶的活性,经SDS-PAGE分析,确定其分子质量为52 ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。     

两种菌产两种不同天然苷类α-鼠李糖苷酶的研究

采用TLC法和分光光度计法研究了Absidia sp.G3g产人参皂苷-α-鼠李糖苷酶(RhaG)和Ab-sidia sp.R9g产芦丁-α-鼠李糖苷酶(RhaR)的酶反应特性。实验结果表明,RhaG只水解人参皂苷Re的C-6位末端上的一个α-鼠李糖基,而RhaR能水解芦丁、橙皮苷、柚皮苷的α-鼠李糖基。两种酶反应条件中相同之处是酶反应最适底物质量浓度为1.0 g/mL、最佳反应pH 5.0,不同之处是RhaG反应的最佳反应温度是50℃,而RhaR则为40℃。     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁-α一鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物，从Absidia sp．R9g的总RNA出发，通过逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)扩增出芦丁-α-鼠李糖苷酶基因片段。将RT-PCR获得的1条1．6kb的目的条带与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

真菌产人参皂苷葡萄糖苷酶基因的调取

根据已知的人参皂苷糖苷酶(GluGF)的N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidia Sp.R84g菌株的总RNA出发,应用RACE技术,快速扩增测序得到cDNA3′末端与cDNA5′末端的未知序列,利用扩增测序所得到的cDNA5′末端和cDNA3′末端的序列设计引物,进行二次RT-PCR扩增并测序得到GluGF基因的...     

植物来源穿山龙皂苷酶的分离提纯及其酶性质

对从麦麸中提取的穿山龙薯蓣皂苷酶进行分离提纯并对其酶性质进行鉴定．结果表明，该酶的分子质量约为65km该酶不仅能水解穿山龙薯蓣皂苷的α-鼠李糖基，也能水解人参皂苷Rc的20-O-α-阿拉伯糖基和3-O-β-葡萄糖基，酶反应的最佳温度为40℃，最适pH值为5．     

人参皂甙—α—鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质

主要研究微生物sp．G9产皂甙鼠李糖苷酶的分离提纯及其酶性质。该酶能够水解人参皂甙Re的C-6位末端上的一个α-鼠李糖基，从而制备人参皂甙Rg1。该酶蛋白的分子量约为54kDa，且酶反应的最佳温度是40℃，最适pH值是5。     

把人参二醇类皂苷转化为Rg3的特种人参皂苷糖苷酶生成的细菌筛选

采用TLC、HPLC等酶活力检测方法对Arthrobacter sp．3、Rhodanobacter sp．14、Rhodopseudomonas sp．18和Enterobacter sp．20菌进行了菌种筛选。其中Arthrobacter sp．3、Rhodopseudomonas sp.18和Enterobncter sp．20菌发酵生成把人参二醇类皂苷PPD转化为Rg3、Rh2和苷元的特殊人参皂苷糖苷酶，Arthrobacter sp．3菌发酵产酶速度相对快一些。Rhodanobacter sp．14发酵主要生成能把人参二醇类皂苷PPD转化为Rd的人参皂苷糖苷酶。Rhodanobacter sp．14发酵生成的人参皂苷糖苷酶对丙酮抗性较好，Arthrobacter sp．3、Rhodopseudomonas sp．18和Enterobacter sp．20菌所生成的人参皂苷糖苷酶对丙酮抗性略差。综合各因素，选取Arthrobacter sp．3为目标菌种。     

转化人参二醇类皂苷为C-K的特异人参皂苷糖苷酶的纯化及性质

研究了真菌sp.g848p发酵产生的把人参二醇类皂苷PPD转化为人参皂苷C-K的特异的人参皂苷糖苷酶,及该酶的分离提纯。该酶经DEAE-Cellulose离子交换柱分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯,得到纯酶,其酶的分子质量约为74 ku。这种特异的人参皂苷糖苷酶能水解人参二醇类皂PPD生成稀有人参皂苷C-K,该酶最适反应时间为24 h,最适反应温度为45℃,最适pH为5.0。     

转化人参二醇类皂苷为C-K的特异人参皂苷糖苷酶的纯化及性质

研究了真菌sp.g848p发酵产生的把人参二醇类皂苷PPD转化为人参皂苷C-K的特异的人参皂苷糖苷酶,及该酶的分离提纯。该酶经DEAE-Cellulose离子交换柱分离、聚丙烯酰胺凝胶电泳提纯,得到纯酶,其酶的分子质量约为74 ku。这种特异的人参皂苷糖苷酶能水解人参二醇类皂PPD生成稀有人参皂苷C-K,该酶最适反应时间为24 h,最适反应温度为45℃,最适pH为5.0。     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁 α 鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidiasp.R9g的总RNA出发,通过逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)扩增出芦丁 α 鼠李糖苷酶基因片段。将RT PCR获得的1条1.6kb的目的条带与pMD18 T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

人参皂甙-α-鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质

主要研究微生物sp.G9产皂甙鼠李糖苷酶的分离提纯及其酶性质。该酶能够水解人参皂甙Re的C 6位末端上的一个α 鼠李糖基,从而制备人参皂甙Rg1。该酶蛋白的分子量约为54kDa,且酶反应的最佳温度是40℃,最适pH值是5。     

人参皂苷Rd的分离提纯

为了得到人参皂苷Rd，从西洋参中提取人参总皂苷，再分离得到人参二醇皂苷，其得率为6％．并采用硅胶柱层析法对人参二醇皂苷进行分离，从而得到较纯的人参皂苷Rd．结果表明，在硅胶柱分离中，从30g二醇类皂苷分离得到含人参皂苷Rd的皂苷9．46g，得率为32．5％，得到较纯人参皂苷Rd4．70g．得率为15．6％．采用结晶的方法对1g样品（硅胶柱分离后的较纯人参皂苷Rd）进行提纯．得到人参皂苷Rd500mg，得率为50％，其纯度为98％左右．     

GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件

为提高Arthrobacter chlorophenolicus GS0202菌所产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rb1生成人参皂苷Rg3的能力,采用单因素研究方法,对菌体发酵条件,及其所产酶的酶反应条件进行了研究.结果表明,菌体发酵的最适培养基组成为胰蛋白胨10 g,酵母粉 5 g,氯化钠10 g,水1 L;诱导物为人参总皂苷,其加入量为3.2 mg/mL,培养温度为28 ℃;酶反应的最适条件为25 ℃,pH 4,底物质量浓度为3 mg/mL.     

GS0202菌产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶条件及其酶的反应条件

为提高Arthrobacter chlorophenolicus GS0202菌所产人参皂苷-β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷Rb1生成人参皂苷Rg3的能力,采用单因素研究方法,对菌体发酵条件,及其所产酶的酶反应条件进行了研究。结果表明,菌体发酵的最适培养基组成为胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,氯化钠10 g,水1 L;诱导物为人参总皂苷,其加入量为3.2 mg/mL,培养温度为28℃;酶反应的最适条件为25℃,pH 4,底物质量浓度为3 mg/mL。