牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用Hi Trap Protein G HP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光。结论本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法采用超速离心纯化的IBRV全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后血清抗体呈阳性的小鼠脾细胞,通过融合剂PEG与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接免疫荧光法(IFA)筛选杂交瘤细胞,并制备腹水,分析单抗的生物学特性。结果筛选出1株稳定分泌抗IBRV gD蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为3C1。单抗的重链为IgG1亚类,轻链为kappa链;上清和腹水效价分别为1∶40和1∶12 800;单抗可与IBRV及gD重组蛋白分别在相对分子质量71 000和96 000处发生特异性反应,可与感染IBRV的MDBK细胞发生特异性结合,产生荧光。结论成功制备了抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体,为深入研究gD蛋白功能及IBR的临床诊断方法筛选等提供了数据材料。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体。对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析。结果获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性。结论制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因真核表达载体的构建及其在MDBK细胞中的表达

目的构建牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD基因的真核表达质粒,并在MDBK细胞中表达。方法参照GenBank中BHV-1-gD基因序列,于上下游分别加入KpnⅠ、BSTBⅠ双酶切位点,连接至真核表达载体pcDNA4-myc-His中,全基因合成重组质粒pcDNA4-gD-His,经双酶切及测序鉴定正确后,转染MDBK细胞,收集上清,镍柱纯化带有His标签的重组gD蛋白,对表达及纯化的蛋白进行间接免疫荧光及Dot blot鉴定。结果质粒pcDNA4-gD-His经双酶切及测序鉴定证明构建正确。表达及纯化的重组gD蛋白相对分子质量约为61 000,纯化后的重组gD蛋白浓度为0. 85 mg/mL。表达及纯化的重组gD蛋白均可与IBRV-gD单克隆抗体发生反应,具有良好反应原性。结论已成功构建了pcDNA4-gD-His真核表达质粒,并在MDBK细胞系中成功表达,经验证重组蛋白具有良好的反应原性。     

传染性喉气管炎病毒gD基因重组禽痘病毒的制备、纯化及初步鉴定

目的制备传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD基因重组禽痘病毒,并进行纯化及初步鉴定。方法将含有ILTV河南长葛株gD基因的禽痘病毒转移载体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞,采用蓝色蚀斑筛选纯化重组禽痘病毒,并经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)进行鉴定。结果经过5轮蚀斑筛选纯化,获得1株重组禽痘病毒rFPV-ILTV-gD,其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,可见约1400bp的ILTVgD特异性条带。IFA检测显示重组禽痘病毒中的ILTVgD基因得到了表达。结论已成功制备并纯化了ILTVgD基因重组禽痘病毒,为预防ILT提供了新的途径。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白的真核表达及其多克隆抗体的制备

目的真核表达及纯化牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gE蛋白,并制备其多克隆抗体。方法合成IBRV gE基因全长,并加入KpnⅠ和BSTBⅠ酶切位点,连接至真核表达载体pCDNA4-MycHis,构建重组质粒pCDNA4-gE-His,经双酶切鉴定正确后转染MDBK细胞系,镍柱纯化带有His标签的重组gE蛋白。将纯化后的重组gE蛋白皮下多点注射新西兰白兔,制备多克隆抗体并纯化,利用Dot blot和间接ELISA方法分析其抗原性。结果重组质粒pCDNA4-gE-His经双酶切鉴定证明构建正确,转染MDBK细胞系后,表达的重组gE蛋白相对分子质量约为61 000,纯化后浓度为50μg/mL。制备的多克隆抗体纯化后浓度为1 mg/mL,经Dot blot和ELISA方法鉴定,重组gE蛋白具有良好的抗原性。结论真核表达了IBRV重组gE蛋白,成功制备了抗gE多克隆抗体,表达产物具有良好的抗原性,为诊断方法的建立以及疫苗和IBRV致病机制等相关研究奠定基础。     

抗SARS刺突蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体,用于SARS研究。方法大肠杆菌中表达的SARS-S2蛋白经纯化后免疫小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备单克隆抗体,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果所制备的抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体,能与表达的SARS-S2蛋白发生特异性结合。结论已获得了抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。     

牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备牛坏死杆菌43KOMP单克隆抗体,并鉴定其生物学特性.方法 经IPTG诱导表达重组43KOMP,纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗43K OMP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗43K OMP单克隆抗体进行效价、亚类、免疫原性及特异性鉴定.结果 获得3株稳定表达抗43...     

呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用对羧基苯甲醛合成1-氨基乙内酰胺脲(AHD)的衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(4-CPAHD),通过活性脂法将4-CPAHD与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原4-CPAHD-BSA和包被抗原4-CPAHD-OVA,采用紫外分光光度法检测偶联是否成功。将人工合成抗原4-CPAHD-BSA免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选能稳定产生抗体的细胞株;通过间接ELISA法检测该细胞株分泌的单克隆抗体的效价、邻硝基-PAHD(2-NPAHD)对单克隆抗体的半数抑制浓度(IC50),并分析抗体的特异性。结果偶联后4-CPAHD-BSA的最大吸收峰有较明显的偏移,表明4-CPAHD与BSA偶联成功,平均偶联比为17.4∶1。制备的单克隆抗体的效价为1∶64 000,2-NPAHD对单克隆抗体的IC50为1.45μg/L,单克隆抗体与同类抗生素及其代谢物无交叉反应。结论制备的AHD单克隆抗体各项指标均较好,为呋喃妥因代谢物免疫检测试剂的研发奠定了基础。     

肾综合征出血热病毒84-Fli株单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndromes,HFRS)病毒特异性单克隆抗体。方法以汉坦病毒84-Fli株抗原纯化液免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得单克隆抗体,利用IFA、SDS-PAGE和Western blot法鉴定其生物学特性。结果成功筛选出阳性杂交瘤细胞株4F6,能稳定且持续分泌抗HFRS病毒的单克隆抗体,亚类鉴定结果为IgM,可与HFRS病毒蛋白在相对分子质量约50 000处发生特异性反应,具有较好的专属性。结论成功制备了1株抗HFRS病毒的单克隆抗体,为进一步研究该病毒感染的诊断、治疗及其预防方法奠定了基础。     

抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组蛋白p GEX-MIC6作为抗原免疫BALB/c小鼠,收集脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,对融合后的杂交瘤细胞进行筛选后,经腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水,鉴定单抗的亚类。采用辛酸-硫酸铵法结合蛋白亲和层析柱纯化腹水,SDS-PAGE分析抗体的相对分子质量,间接ELISA法检测抗体效价及特异性,BCA蛋白浓度检测试剂盒测定抗体浓度。结果最终获得两株能稳定分泌新孢子虫MIC6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A1和1H11,分泌的抗体分别属于Ig G1和Ig G2b亚类。纯化后的腹水经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约为50 000的重链和25 000的轻链条带,纯化效果较好;1A1和1H11的腹水效价分别为5.12×104和1.024×105,浓度分别为0.935和2.010 mg/ml,两株单抗均能特异性识别新孢子虫,与弓形虫无交叉反应。结论制备的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体特异性较强,为进一步研究新孢子虫MIC6的生物学功能及建立特异敏感的新孢子虫检测方法奠定了基础。     

抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并进行鉴定。方法以细粒棘球绦虫Ediag A864蛋白为抗原,经皮下多点免疫BALB/c小鼠,共免疫4次。末次免疫3 d后制备小鼠脾细胞,在聚乙二醇(PEG)的作用下与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株进行克隆,检测其染色体数及分泌的单克隆抗体亚型。采用体内培养法大量制备抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,并经正辛酸-饱和硫酸铵法和Hi Trap Protein G HP亲和层析结合法纯化。结果经筛选克隆共获得4株可产生细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体的杂交瘤细胞株:2D12、3H4、4A6和6E5,细胞染色体数分别为97、101、98和96,重链亚型均为Ig G1,轻链亚型均为Kappa。2D12、3H4腹水效价为2×105,4A6和6E5腹水效价为1×105。纯化后的2D12抗体可见相对分子质量为46 000和26 000的重链和轻链条带。结论本实验获得的2D12是一株稳定的杂交瘤细胞株,且可产生高效价细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体,为细粒棘球绦虫病的免疫诊断奠定了基础。     

抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)重组磷蛋白(p24)多克隆抗体,并对其进行鉴定,为BDV血清免疫学检测方法的建立奠定基础。方法用本课题组前期制备的重组BDVp24蛋白经背腿部多点皮下注射免疫新西兰大白兔,共免疫4次,末次免疫后第7天采血,分离血清,采用抗原亲和纯化法纯化抗血清,ELISA法测定抗血清效价;Western blot和免疫荧光鉴定其特异性。结果制备的抗BDV p24多克隆抗体的纯度为98%,ELISA效价达1∶128 000,该抗体与重组p24蛋白和BDV感染OL细胞表达的p24蛋白均能发生特异性反应。结论成功制备了灵敏性和特异性良好的抗BDV p24多克隆抗体,为研发相关的诊断试剂和研究该病毒的感染发病机制奠定了基础。