多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA

目的采用多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留DNA。方法采用滤芯(滤板)澄清、鱼精蛋白处理、核酸酶处理、Sepharose 4FF层析纯化或澄清、核酸酶、Sepharose 4FF层析纯化结合的方法去除Vero细胞培养的狂犬病病毒液中的Vero细胞DNA,检测Vero细胞DNA残留量、抗原含量、核酸酶残留量及疫苗效价。结果 0.45μm UB玻璃纤维澄清病毒液,抗原损失率较小;鱼精蛋白去除Vero细胞DNA,抗原损失量较大;核酸酶处理后,病毒液中Vero细胞DNA残留量仍高于1 ng/ml;经Sepharose 4FF层析纯化,能有效去除浓缩后经核酸酶处理的病毒液中的核酸酶及一定量的Vero细胞DNA;采用多种方法结合去除病毒液中Vero细胞残留DNA,DNA残留量<100 pg/ml,疫苗效价≥4.0 IU/ml,均达到《中国药典》三部(2010版)要求。结论多种方法结合能有效去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量,且疫苗效力达到《中国药典》三部(2010版)要求。     

双价肾综合征出血热纯化疫苗(Vero细胞)的纯化工艺

目的　研究肾综合征出血热抗原的纯化工艺。方法　用Vero细胞繁殖肾综合征出血热病毒 ,经过灭活、浓缩 ,Sepharose 4FF凝胶过滤纯化。结果　用Sepharose 4FF柱层析纯化时 ,2 80nm监测收集到 3个吸收峰 ,其中第 1峰为抗原峰 ,将第 1峰稀释配制后进行动物实验 ,表明按照该工艺制备的Vero细胞纯化疫苗安全有效。结论　本研究为肾综合征出血热纯化疫苗的研制奠定了基础。     

甲型肝炎病毒复合层析介质Capto Core 400的纯化效果

目的 探索新型复合层析介质Capto Core 400层析填料纯化甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的效果。方法用Capto Core 400层析介质纯化人胚肺二倍体细胞(2BS株)培养收获的HAV粗纯液,经流速(60、150、300、450 cm/h)、上样缓冲液pH(6.6、7.0、7.4)、上样缓冲液盐离子浓度(0、0.15、0.3、0.45 mol/L)、载量[0.5、1、2、4柱体积(column volume,CV)]筛选最适纯化HAV的条件,并与传统Sepharose 4FF层析介质纯化效果进行比较。结果 初步确定Capto Core 400纯化工艺条件为流速150 cm/h、上样缓冲液pH 7.0～7.4、盐离子浓度0.15 mol/L、上样量2 CV时,纯化效果最好,病毒回收率平均为92.61%,蛋白去除率平均为84.25%。Sepharose 4FF层析介质纯化HAV抗原回收率平均为76.03%,蛋白去除率平均为73.21%,Capto Core 400层析介质纯化效果优于Sepharose 4FF层析介质。结论Capto Core 400复...     

两种凝胶过滤介质纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒效果的比较

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗原及蛋白含量,计算比活性、蛋白去除率及抗原回收率,确定病毒峰收集范围。取抗原含量最高的病毒收获液,利用DEAE Sepharose FF离子交换填料进行纯化后,检测Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量。结果 Sepharose 6FF填料按6%柱体积上样进行凝胶纯化,纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液抗原回收率均值分别为78.69%、78.03%和78.37%,与Sepharose CL-6B填料按3%柱体积上样(77.29%、78.60%和77.36%)相比,差异无统计学意义(P0.05)。两种填料纯化的各型收获液再经离子交换纯化后,蛋白去除率、比活性、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,两种填料纯化的各型收获液比活性差异无统计学意义(P0.05)。结论使用Sepharose 6FF纯化的各型病毒纯化液抗原回收率和比活性与Sepharose CL-6B无明显差异,但可以减少纯化的上样次数,大幅提高纯化效率,可用Sepharose 6FF替换Sepharose CL-6B。     

Vero细胞疫苗生产过程中宿主细胞蛋白含量分析

目的了解Vero细胞疫苗中间产品中宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)的含量变化。方法模拟Vero细胞疫苗生产工艺流程,制备Vero细胞HCP,免疫家兔制备Vero细胞HCP免疫血清,经Protein ASepharose CL-4B亲和层析,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG,通过SDS-PAGE和Western blot分析Vero细胞乙型脑炎疫苗及Vero细胞SARS疫苗各中间产品的蛋白、HCP及病毒抗原成分的含量变化。结果Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗中间产品中均存在一定量HCP,不同的纯化工艺均可以去除大部分HCP,随着生产工艺的进行,疫苗中间产品中HCP的含量逐渐降低,病毒成分的纯度逐渐增高,但纯化后产品中仍存在少量HCP。结论Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗均存在一定量HCP。     

乙型脑炎病毒的生物反应器培养及其灭活和纯化

目的利用NBS 14 L篮式生物反应器大规模培养乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),并对病毒收获液进行灭活和纯化,为乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)的大批量生产提供参考。方法用NBS 14 L篮式生物反应器,以片状载体FibralCel DISKⅠ为载体,进行Vero细胞高密度培养,分别按0.01、0.1和0.3 MOI接种JEV(P3V2)毒种,灌流培养,收获3批病毒液,检测病毒滴度;分别使用不同浓度的甲醛(100、200、400 ng/ml)于4、25℃和不同浓度的β-丙内酯(β-丙内酯︰病毒液分别为1︰2 000、1︰4 000、1︰8 000)于4℃对病毒收获液进行灭活,取灭活后的病毒液,接种昆明小鼠,验证病毒灭活效果;用截留相对分子质量为10万的超滤器对病毒收获液进行超滤浓缩,用Sepharose 4FF层析柱对病毒浓缩液进行层析纯化。结果共培养3批Vero细胞,平台期密度约为1.6×107个/ml。3批病毒收获液的滴度分别为8.4、8.1和7.9 lgLD50/ml。以甲醛为灭活剂,作用浓度为200 ng/ml,温度为4℃时,作用7 d可完全灭活病毒,且免疫原性合格;以β-丙内酯为灭活剂,作用浓度为1︰4 000,温度为4℃时,作用12 h可完全灭活病毒,且免疫原性合格。3批病毒浓缩液病毒液经Sepharose 4FF层析柱层析纯化后,蛋白去除率达99%以上,抗原回收率在95%以上,Vero细胞蛋白质残留量和DNA残留量均符合《中国药典》三部(2010版)的相关规定。结论成功实现了JEV的大规模生物反应器培养,层析纯化后病毒的抗原回收率较高,为乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)的大批量生产提供了参考。     

首批Vero细胞蛋白质对照品的研制

目的建立首批Vero细胞蛋白质国家对照品,用于人用狂犬病疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试验的验证。方法本对照品系采用狂犬病病毒固定株接种Vero细胞,经培养、收获、浓缩、灭活病毒、纯化后,加入适量的人血白蛋白、右旋糖酐40冻干制成。本对照品蛋白含量溯源于Vero细胞蛋白质标准品(250022-201901),应用Vero细胞分泌型蛋白检测试剂盒(ELISA)对其进行标定后赋值。随机选取16支标准品,测定其pH值,采用方差分析统计检验均匀性;随机选取对照品,分别在4、25和37℃放置不同时间(1、2、3和4周),不同时间点取3支,以Vero细胞蛋白质标准品(250022-201901)绘制标准曲线,ELISA法测定蛋白含量,采用方差分析统计检验稳定性。结果经协作标定,本对照品标示量值为7.7μg/mL,参考范围为(7.7±3.6)μg/mL,均匀性及稳定性良好。结论Vero细胞蛋白质对照品已获批使用,批号为250023-201901,该对照品的建立,对加强人用狂犬病疫苗的质量控制具有重要意义。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒的适用性验证

目的对病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒进行适用性验证。方法将不同细胞基质制备的乙型脑炎灭活疫苗、人用狂犬病病毒疫苗共16批编盲后,每批疫苗均质等量分为44份,分别分发给3个实验室,用同批ELISA-Vero细胞宿主蛋白检测试剂盒进行检测,对试剂盒进行适用性验证,考核试剂盒的专属性、精密性、线性和范围等指标。结果3个实验室检测每批样品44次,原代地鼠肾细胞和鸡胚细胞为基质的疫苗检测结果均为阴性,以Vero细胞为基质的疫苗检测结果均为阳性。16份样本44次检测结果的变异系数在7.34%～14.77%之间,均低于15%;相对线性范围在12.5～400 ng/ml之间。16份疫苗中6批Vero细胞乙脑疫苗和5批人用狂犬病病毒疫苗检出的细胞宿主蛋白残留量分别在153.3～5 850.9 ng/ml和1 895.7~40 625.1 ng/ml之间。结论疫苗中Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒具有较好的专属性、精密性和线性,可用于Vero细胞为基质的病毒类疫苗宿主蛋白残留量的检测。     

应用40L生物反应器制备人用狂犬病疫苗

目的应用40 L生物反应器大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以PV2061株狂犬病病毒为毒种,Vero细胞为基质,应用CelliGen 510生物反应器(40 L),灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制备人用狂犬病疫苗,并对生产过程中各步骤工艺进行取样检测。结果细胞培养密度达1. 2×10~7个/m L,病毒感染后可连续收获约16 d,病毒收获液最高滴度为7. 4 LgLD50/m L。经纯化,杂蛋白去除率达98%以上,成品宿主细胞DNA含量≤50 pg/剂,效价≥4. 5 IU/剂,每罐产量可达13万剂疫苗。结论 CelliGen 510生物反应器可应用于大规模生产人用狂犬病疫苗,疫苗成品检定符合《中国药典》三部(2015版)相关标准。