大肠埃希菌对人结肠癌细胞RKO产生β防御素-3的影响

<正>β防御素是天然抗菌肽家族的重要成员,同时也是机体先天性防御屏障的重要组成部分,对细菌、真菌和病毒入侵机体具有重要的防御作用~[1-2]。β防御素-3通常受外界环境的刺激而产生~[3],在人体上皮细胞和黏膜组织中广泛表达,具有广谱的抗微生物活性,能促进伤口愈合,发挥免疫调节     

大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶基因型分析

目的研究临床分离产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌医院感染的临床分布及其基因型特征,为临床合理用药治疗大肠埃希菌引起的感染提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)分别检测162株产ESBLS大肠埃希菌3种易常见的ESBLS基因TEM,SHV和CTX-M并对其标本来源和科室分布进行分析。结果ESBLS大肠埃希菌最多的科室为重外科(22.9%),可能与手术预防性用抗生素的因素有关。     

黄芩苷对大肠埃希菌的抗菌活性及其作用机制

目的探讨黄芩苷对大肠埃希菌的抗菌活性及具可能的作用机制。方法在检测黄芩苷对大肠埃希菌最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及抑菌活力的基础上,进一步检测1倍MIC的黄芩苷对大肠埃希菌胞外乳酸脱氢酶活力、前向散射光及DNA含量的影响。结果黄芩苷对大肠埃希菌的MIC为7 mg/mL,干预2 h时即可达到抑菌活性高峰。1倍MIC的黄芩苷作用大肠埃希菌后,菌液中乳酸脱氢酶活力逐渐上升,8 h时抑菌活力高达(201. 48±19. 06)U/L。1倍MIC的黄芩苷作用大肠埃希菌2 h后,细胞体积缩小、DNA含量减少,与对照组相比,差异均有统计学意义(P <0. 05)。结论黄芩苷通过对大肠埃希菌细胞膜造成损伤而增加其通透性,使菌体物质大量外渗,从而实现其抗菌活性。     

人β防御素-3的研究进展

人防御素是一类人体内源性抗微生物阳离子短肽,富含精氨酸,以其广谱高效的抗菌活性和独特的作用机制,成为人体天然免疫体系的重要组成部分。在人防御素家族中,人β防御素-3(HBD-3)具有较强的抗菌活性和更广的抗菌谱,对盐浓度相对不敏感,对宿主细胞毒性低,这些特点使其成为当前研究的热点。本文就其结构特征、生物学功能及其在抗感染方面的应用前景等方面的研究进展作一概述。     

人工神经网络优化大肠埃希菌摇瓶培养基

目的 采用人工神经网络(artificial neural network,ANN)优化一种可获得高生物量及菌体活力大肠埃希菌(E.coli)的摇瓶培养基。方法 以葡萄糖(glucose,Glu)、酵母浸出物(yeast extract,YE)、酵母蛋白胨(yeast peptone,YP)、大豆蛋白胨(soy peptone,SP)和酵母基础氮源(yeast nitrogen base,YNB)占比为混料分量,菌体悬浮液A₆₀₀(A1)、培养物湿菌重(G,g/L)和菌体活力指标值(A2,A₄₆₀)为响应值,采用混料设计试验筛选对响应值具有显著影响的混料分量。以混料设计试验结果为训练和验证数据样本构建ANN模型,输入变量为混料分量且约束同混料分量上下限,输出变量为混料设计响应值。通过所构建ANN获得的优化后培养基配方和参考值,应用蒙特卡洛模拟进一步调整培养基配方,并获得E.coli摇瓶培养基配方,再对培养基配方进行10次验证试验。结果 E.coli摇瓶培养基配方：Glu 26 g/L、SP26 g/L、YNB 13 g/L,培养基总浓度为65...     

脂多糖对人结肠癌细胞产生β-防御素3的影响

目的分析脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对人结肠癌RKO细胞产生的β-防御素3(mouseβ-defensins-3,mBD-3)的影响。方法将不同浓度(0、10、20和40 ng/ml)的LPS作用于RKO细胞0、24、48和72 h,MTT法检测LPS对RKO细胞的最佳抑制浓度;定量RT-PCR及Western blot法检测LPS作用的RKO细胞中mBD-3的表达情况。结果 LPS对RKO细胞的抑制作用在浓度20 ng/ml、培养48 h时最佳。10、20和40 ng/ml LPS作用的RKO细胞,mBD-3 mRNA及蛋白表达水平均明显高于0 ng/ml LPS组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 LPS可以促进mBD-3的表达,为进一步研究mBD-3的产生机制奠定了基础。     

犊牛腹泻大肠埃希菌O-抗原血清型鉴定

目的对犊牛腹泻大肠埃希菌O-抗原血清型进行鉴定。方法收集内蒙古部分地区牛场患犊牛腹泻病的犊牛直肠内容物或粪便共165份,经细菌分离培养、动物致病性试验及16s RNA PCR检测,筛选出致病性大肠埃希菌,并进行O-抗原血清型鉴定。结果分离的大肠埃希菌共165株,115株有致病性,除7株未能确定分型及3株自凝集外,其余105株鉴定为O-抗原血清型。结论大肠埃希菌O-抗原血清型鉴定对流行病学调查及疾病预防均有重要意义。     

受污染缢蛏大肠埃希氏菌的净化研究

本研究探讨了受污染缢蛏在海水理化特性:水温:22℃,pH:7.9,盐度:31.2 ppt,溶解氧:7.02 mg/L,颜色及透明度:无色透明;实验室室温:25℃,湿度:65%的条件下充气放养几天才能使大肠埃希氏菌完全净化。试验结果表明该缢蛏样品经过海水的暂养和净化,可以降低其大肠埃希氏菌和菌落总数的数量,而且暂养的时间越长,样品中大肠埃希氏菌和菌落总数的数量越少。     

1株牛源大肠埃希菌的分离及鉴定

目的分离及鉴定内蒙古自治区通辽市某牛场犊牛腹泻致病菌。方法无菌采集犊牛腹泻粪便,通过分离培养、染色镜检、致病性检测、药敏检测、生化鉴定、16S r RNA PCR鉴定、血清型鉴定及系统进化树的构建进行病原研究。结果致病菌的16S rRNA基因序列与大肠埃希菌的相似性在99%以上;生化鉴定该致病菌为大肠埃希菌的置信度为99%,在20种常用药品中仅对阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南敏感;血清鉴定该大肠埃希菌菌株的血清型为O17。结论该致病菌鉴定为大肠埃希菌,该菌具有多重耐药性,有成为人畜共患病病原的潜在可能。该研究为通辽地区牛场流行的大肠埃希菌防控提供了参考。     

大肠埃希菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸

目的为大规模工业化生产S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)提供一套经济合理的生产工艺。方法将经DNA序列测定正确的SAM合成酶基因(SAMS)片段,经Eco RⅠ和NotⅠ双酶切,亚克隆至大肠埃希菌表达载体p ET-28a上,构建SAMS基因重组表达质粒p ET-28a-SAMS。将重组表达质粒转入大肠埃希菌表达宿主BL21(DE3),构建大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)。采用混合悬浮培养法,利用含有SAMS基因的重组大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)中的SAM合成酶系和酿酒酵母JM-310中的ATP生物合成酶系,构建一个以葡萄糖为能源的中间偶合ATP再生系统,并对两种细胞的偶联合成比例、偶联时间、通透剂的种类及浓度、偶联缓冲液主要成分的浓度进行优化。结果经双酶切及菌落PCR鉴定证明,重组表达质粒p ET-28a-SAMS及大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)构建正确。大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)与酿酒酵母的最佳偶联合成比例为4∶1,最佳偶联时间为5 h,添加5%甲苯通透效果最好,200 mmol/L磷酸缓冲液、200 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L腺苷、30 mmol/L Mg Cl2·6H2O、30 mmol/L L-甲硫氨酸为最适偶联缓冲体系。最佳偶联条件下,偶联系统中SAM的浓度最高达1.7 g/L,对照组中SAM的浓度为0.17 g/L。结论本研究建立的方法操作方便,工艺简单,为SAM的廉价生产提供了一条新的途径。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性分析

目的分析临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布情况及耐药性。方法收集吉林大学中日联谊医院临床标本中分离的221株大肠埃希菌和152株肺炎克雷伯菌,采用纸片扩散法检测抗菌素的敏感性;双纸片协同试验和纸片表型确证试验筛选并确证产超广谱β-内酰胺酶的菌株;按照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)2005年版的标准判断结果。结果大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的敏感性最高,均达100%;对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦和头孢西丁的敏感性也较高,均大于70%,而对氨苄西林的耐药性均大于90%。共检出产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌118株,检出率为53.4%;肺炎克雷伯菌21株,检出率为13.8%;产超广谱β-内酰胺酶的两种菌株与非产超广谱β-内酰胺酶的同种菌株相比,对抗菌素的耐药性均明显增加。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌仍是产超广谱的β-内酰胺酶的主要菌株,且对常用抗菌素产生了较高的耐药性。     

肠出血性大肠埃希菌O157免疫磁珠的制备

目的制备可高效、特异性富集肠出血性E.coli O157(enterohemorrhagic Escherichia coli O157,EHEC O157)的免疫磁珠。方法分别用5种不同规格磁珠与E.coli O157特异性单克隆抗体偶联制备免疫磁珠,通过比较磁珠蛋白偶联量,选取包被效果最佳的磁珠规格;对制备工艺进行优化(包括活化时间、温度,偶联缓冲液p H值,偶联温度、时间);对制备的O157免疫磁珠选择性集菌的敏感性和特异性进行评价,并与进口磁珠吸附率进行比较。结果直径0.5~1.0μm羧基磁珠抗体包被效果及目的菌分离效果最好。加入NHS后,活化30 min为最佳时间;4℃磁珠活化温度、0.01 mol/L PBS(p H 7.4)构成的体系对磁珠偶联单克隆抗体效果最佳;偶联温度为37℃、偶联时间为120 min时,偶联蛋白量最高,且波动范围较小,为最佳偶联温度及时间。在复杂的微生物环境中,O157免疫磁珠的敏感性达到20 CFU/ml。在混合菌液中,E.coli O157菌含量在1.4×10~3 CFU/ml时,免疫磁珠特异性捕获率达到90%。结论获得羧基磁珠与E.coli O157单克隆抗体偶联的最佳条件。制备的免疫磁珠能够特异性富集EHEC O157,具有操作简便,分离速度快,捕获率高等特点,可用于临床样品或食品中EHEC O157的分离鉴定。     

大肠埃希菌表达的重组生物制品种子批质量控制

正近年来,DNA重组技术在生物医药领域获得了迅速发展~([1-2])。《中国药典》三部(2015版)中,对人用重组DNA蛋白制品进行了定义:人用重组DNA蛋白制品是采用重组DNA技术,对编码所需蛋白质的基因进行遗传修饰,利用质粒或病毒载体将目的基因导入适当的宿主细胞,表达并翻译成蛋白质,经过     

123株产ESBLs大肠埃希菌耐药监测结果分析

目的了解临床常用抗菌药物对我院临床分离产ESBLs大肠埃希菌的体外抗菌活性。方法采用法国梅里埃VITEK-2仪器微量稀释法测定抗菌药物对产ESBLs大肠埃希菌的体外抗菌活性,按CLSI2007版分析结果。结果20种抗菌药物对于所研究产ESBLs大肠埃希菌的敏感率依次为氨苄西林0.8%、哌拉西林0、氨苄西林/舒巴坦4.9%、哌拉西林/三唑巴坦95.1%、头孢唑林0、头孢呋肟0、头孢替坦98.4%、头孢他啶0、头孢曲松0、头孢吡肟0、亚胺培南100%、美罗培南100%、氨曲南0、庆大霉素36.6%、妥布霉素44.7%、阿米卡星95.1%、左旋氧氟沙星18.7%、环丙沙星16.3%、甲氧苄啶/磺胺恶唑28.5%、呋喃妥因82.1%。结论目前碳青霉烯类是对产ESBLs大肠埃希菌最为有效的一类抗菌药物。另外对产ESBLs大肠埃希菌较为有效的药物还有哌拉西林/三唑巴坦、头孢替坦、阿米卡星。     

益生菌对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用

以11%脱脂牛奶和MRS肉汤作为培养基,在适宜大肠埃希菌O157:H7生长的条件(37℃,有氧)下,考察益生菌混合物对大肠埃希菌O157:H7生存生长的影响。前期实验获得了5株益生菌和大肠埃希菌O157:H7各自的生长曲线,确认了酸性条件(培养基pH值为3.8)对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用。经过对酸性环境的适应并不能提高大肠埃希菌O157:H7菌株对益生菌的抵抗能力。大肠埃希菌O157:H7(37℃,有氧状态培养8 h)不能在经过益生菌有氧状态下培养后的培养基澄清液中存活,但将该澄清液的pH值调到6.5(新鲜MRS肉汤培养基的pH值),大肠埃希菌O157:H7又可以在其中生长。结果表明,高浓度的益生菌对大肠埃希菌O157:H7菌株有抑制作用,这一方面是由于益生菌降低了培养环境的pH值,另一方面也是由于益生菌本身在有氧状态下产生了抑制大肠埃希菌O157:H7的代谢产物。     

总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测方法的对比分析

为了探究酶底物法、多管发酵法用于水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测中的效果。通过加标试验检测和实际水样检测等方式,比较酶底物法和多管发酵法对水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测效果算,结果显示两种检测方式在不同菌株检测适用性方面存在一定差异。针对水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测选择酶底物法和多管发酵法结果一致,说明两种方式均可用于水质微生物检测中,均有较为理想的应用效果。     

重组人神经生长因子在大肠埃希菌中的表达及活性测定

目的在大肠埃希菌中表达重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF),并检测其活性。方法通过密码子优化,设计表达rhNGF的基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-hNGF,转化大肠埃希菌BL21pLyS(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的蛋白经层析纯化后,SDS-PAGE及HPLC法检测纯度,Lowry法检测蛋白浓度,TF-1细胞增殖法检测生物学活性。结果构建了融合表达rhNGF的大肠埃希菌表达系统,表达的3批外源蛋白纯化后纯度均达到100%,比活分别为5.5×10~5、6.8×10~5和7.4×10~5 IU/mg,均高于小鼠颌下腺提取的NGF标准品。结论成功表达了rhNGF,纯化后纯度高,比活强,为规模化生产hNGF提供了参考。     

大肠埃希菌细菌膜外蛋白A对小肠上皮细胞增殖的影响及其作用机制

目的探讨大肠埃希菌细菌膜外蛋白A(outer-membrane protein A,OMPA)对小肠上皮细胞增殖的影响及其作用机制。方法采用3种浓度的OMPA(10、20及40 ng/mL)作用于小肠上皮细胞,分别作用0、24、48和72 h,MTT法检测细胞的增殖情况。采用抑制效果最佳浓度的OMPA分别作用小肠上皮细胞0、20、40、60 min,通过Western blot法检测小肠上皮细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中ERK、JNK及p38的磷酸化情况。结果 20 ng/mL的OMPA作用48 h时对小肠上皮细胞的生长抑制程度最大,细胞生长率为(23. 12±0. 21)%。与作用0 min时比较,20 ng/mL的OMPA作用20、40及60 min时,小肠上皮细胞中p-JNK/JNK比值显著降低(P 0. 01),p-ERK/ERK及p-p38/p38差异均无统计学意义(P 0. 05);与作用20 min时比较,20 ng/mL的OMPA作用40及60 min时,小肠上皮细胞中p-JNK/JNK比值显著降低(P 0. 01),p-ERK/ERK及p-p38/p38差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论 OMPA可抑制小肠上皮细胞的增殖,该抑制作用是通过抑制MAPK通路中JNK的磷酸化实现的。