人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut+型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的在毕赤酵母中表达并纯化人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)辅助调节蛋白Vpu。方法从质粒p CDNA3.1-vphu中PCR扩增vphu基因,插入毕赤酵母表达载体p PICZαA,构建重组表达质粒p PICZαA-vphu,转化巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达带有6×His标签的重组Vpu蛋白。表达产物经Ni-Agarose 6×His标签纯化柱纯化。表达和纯化产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-vphu经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约16 000,主要存在于细胞内;纯化后杂蛋白减少,与抗VPU抗体和抗His标签抗体均可结合,浓度为224μg/ml。结论利用毕赤酵母表达系统成功表达并纯化了HIV-1 Vpu蛋白,纯化的蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究其结构和功能以及靶点药物筛选模型的建立奠定了基础。     

花烟草植物防御素1蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化

目的 在毕赤酵母中表达花烟草植物防御素1 (Nicotiala alata defensin 1,NaD1)蛋白,并进行纯化.方法 重组表达质粒pPIC9K-NaD1经Sac Ⅰ内切酶线性化后,电转化至感受态毕赤酵母GS115,采用甲醇进行小量诱导表达,选择表达量相对较高的单菌落进行扩大培养,获得大量重组蛋白NaD1,...     

重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)165b(rhVEGF-165b),并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,SalⅠ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确;表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90%以上,具有人VEGF的抗原性。结论成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达及一步纯化

从绿色木霉中克隆了葡萄糖苷酶bg基因,构建入表达载体pPIC9k-His6中,然后在AOX1启动子的控制下,在毕赤酵母GS115菌株中表达. 在5 L发酵罐中发酵120 h,重组P. pastoris Mut+菌株湿重达360.6 g/L,葡萄糖苷酶浓度和酶活分别为2.1 mg/mL和73.5 U/mL. 经亲和层析一步纯化后,得到了电泳纯的葡萄糖苷酶. HPLC分析显示其纯度为95.6%,比酶活为71.9 U/mg. 纯化过程酶得率为73.6%,纯化倍数为42.6. 纯酶的等电点为5.0,最适温度为50℃,最适pH为6.5. 金属离子Ag+, Ca2+, Cu2+, Fe2+及SDS对葡萄糖苷酶活性有抑制作用,而Mg2+, Mn2+, K+能增强葡萄糖苷酶活性,其中1 mol/L Mg2+能使酶活提高20%.     

人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性

目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。     

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。     

人热休克蛋白73的基因重组、表达和纯化

目的　用基因重组的方法表达人热休克蛋白７３,并纯化表达产物,用于进一步分析。方法　用人 热休克类似蛋白ＨＳＰ７３基因构建原核细胞表达载体ｐＥＴＨＳＰ７３,在大肠杆菌ＢＬ２１中用半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达,用 电泳法和 ＡＴＰ亲和层析法提取 ＨＳＰ７３。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、用３ ａ３抗体 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ作 ＥＣＬ检测。结果人 ＨＳＰ７３基因 构建的载体ｐＥＴＨＳＰ７３能很好地在大肠杆菌表达出相对分子质量为７３　０００的蛋白。两种蛋白提取方法均能有效提纯表达的蛋白,该蛋白具有人ＨＳＰ７３抗原特性。所得蛋白质氨基酸测定和Ｎ端测序的结果与有关的报道一致。结 论　ＨＳＰ７３基因重组、表达和纯化方法的建立,为研究ＨＳＰ７３的结构、功能与临床应用提供了必要条件。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达

去除自行构建的质粒pPIC9K-07ALDH2的信号肽(α-Factor)得到质粒pPIC9K-ALDH2-delsign,采用电转化方法将该质粒转化到Pichia pastorisSMD1168中构建得到能在胞内高效表达人乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因工程菌株Pichia pastorisSMD1168(pPIC9K-ALDH2-delsign)。利用该重组毕赤酵母摇瓶发酵得到的发酵液的人ALDH2的酶活为0.315 U.mL-1,明显高于胞外表达时人ALDH2的酶活;经过亲和色谱分离纯化后的人ALDH2酶液的酶活为0.944 U.mL-1。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子,人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hPTH)基因,将其克隆于M13载体中,DNA测序验证正确。通过PCR从含有hPTH基因的M13载体获得了该基因,将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,构建了重组质粒pPIC9K-hPTH,电击法转化甲醇毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115菌株,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9 3kDa处有明显的诱导蛋白带,与报道的hPTH的相对分子质量相近;酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hPTH免疫活性为132ng/L。     

人Cu,Zn-SOD基因在毕赤酵母中的表达及稳定性

目的构建人Cu,Zn-SOD基因的真核表达载体,转化毕赤酵母,并检测表达产物的稳定性。方法根据酵母密码子偏好性,合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9k中,转化毕赤酵母GS115。甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。优化表达条件,并检测粗酶液的稳定性。结果经SDS-PAGE和Western blot检测,表达的目的蛋白相对分子质量为18000左右;最佳表达条件为pH6.0,甲醇浓度1.5%,持续培养96h;目的蛋白占分泌蛋白总量的27%,最高表达量为91mg/L;最佳条件下培养液上清的酶活性最高达334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,对温度有一定的耐受性,pH在6和8时较稳定。结论在毕赤酵母GS115中成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD基因。     

重组Thermomonospora fusca纤维素酶Ce16A在毕赤酵母中的表达及纯化

目的 在毕赤酵母中表达Thermomonospora fusca纤维素酶Ce16A。方法 提取Thermomonospora fusca基因组DNA作模板，PCR扩增纤维素酶Ce16A基因，克隆到毕赤酵母表达载体pGAPZaA上，用电击法将线性Ce16A-pGAPZαA核酸片段转化毕赤酵母X-33株，克隆PCR鉴定法筛选阳性转化株，培养传代。选择稳定株，培养3d后取培养液上清，用His-Bind Quick Cartridge 300提取表达的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Ce16A。结果 一步His-Bind Quick Cartridge 300层析可提取电泳纯的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Ce16A，SDS-PAGE分析显示相对分子质量约为60000，收率为200mg／L，用羧甲基纤维素法测活性为500U／mg，用滤纸法测活性为1U／mg。结论 已在毕赤酵母中成功表达了Thermomonospora fusca纤维素酶Ce16A。     

重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。方法提取Thermomonospora fusca基因组DNA作模板,PCR扩增纤维素酶Cel6A基因,克隆到毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,用电击法将线性Cel6A-pGAPZαA核酸片段转化毕赤酵母X-33株,克隆PCR鉴定法筛选阳性转化株,培养传代。选择稳定株,培养3d后取培养液上清,用His-BindQuick Cartridge300提取表达的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。结果一步His-Bind Quick Cartridge300层析可提取电泳纯的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A,SDS-PAGE分析显示相对分子质量约为60000,收率为200mg/L,用羧甲基纤维素法测活性为500U/mg,用滤纸法测活性为1U/mg。结论已在毕赤酵母中成功表达了Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A。     

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达

目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。     

人溶菌酶-木聚糖酶融合基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,XynⅡ)融合基因。方法通过PCR技术将hLY基因与XynⅡ基因连接,中间插入肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-XynⅡ-EKsite-hLY,经SacⅠ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCR鉴定为阳性的克隆用甲醇进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和XynⅡ的活性。结果获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和XynⅡ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,XynⅡ的活性达244 U/ml。结论已在毕赤酵母中成功表达了XynⅡ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

胆盐水解酶基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)基因。方法以重组质粒pMD18-BSH为模板,PCR扩增BSH基因,克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,经AvrⅡ线性化,电转化至毕赤酵母SMD1168,PCR筛选阳性重组子,诱导表达,表达产物经Western blot进行分析。结果重组表达质粒pGAPZαA-BSH经双酶切及测序证明构建正确;经PCR鉴定阳性的重组酵母菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约35000的目的蛋白表达条带;表达的重组蛋白可与兔抗植物乳杆菌多克隆抗体发生特异性反应。结论在毕赤酵母中成功表达了BSH,为BSH结构与相关功能及高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。     

核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测

目的利用巴氏毕赤酵母真核表达系统表达人核心蛋白聚糖DCN,并检测其抗肿瘤活性。方法利用DCN的特异引物,通过RT-PCR扩增人DCN基因,与载体pPIC9K连接,将序列正确的重组体扩增后,酶切线性化,通过醋酸锂法转化酵母菌HIS-/GS115,G418筛选阳性克隆,用含1%甲醇的BMMY培养基诱导表达,并观察纯化的表达产物对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)增殖的影响。结果表达产物作用于HepG2细胞后,与对照组相比,细胞增殖数量及速度均显著降低。随着表达产物浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用也增强,并表现出浓度和时间依赖性关系。细胞形态学观察表明DCN对HepG2生长有明显抑制作用。结论已成功构建了pPIC9K-DCN真核表达载体,并表达了有活性的蛋白产物。     

人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性

目的利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 L1 VLP菌种。采用15 L发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 L1VLP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 L1 VLP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 L1 VLP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 L1 VLP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 L1 VLP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/L,且可与小鼠抗HPV L1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 L1 VLP在小鼠体内的半数有效剂量(ED_(50))为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 L1 VLP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。