KMB-17细胞株的遗传稳定性

目的研究连续传代的KMB-17细胞株的遗传稳定性。方法将第23代KMB-17细胞连续传代至60代,按常规染色体分析方法,观察不同代次细胞的染色体数目和结构变化。选取核基因组和线粒体基因组中高突变的15个STR位点,经PCR扩增和电泳分析微卫星不稳定性。结果KMB-17细胞株经连续传代培养至56代仍未发生染色体数目和结构改变,微卫星位点也未发生突变。结论KMB-17细胞株连续传代培养后,仍能保持细胞生物学特征及遗传特征的稳定,40代以前的细胞作为疫苗生产基质是安全的。     

EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)毒种FY23-KB株的遗传稳定性

目的探讨肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)毒种FY23-KB株在KMB-17细胞中连续传代的遗传稳定性。方法比较疫苗株FY23-KB在Vero细胞中生长的第2代(FY23-V-2)与在KMB-17细胞中适应性生长的第12(FY23-KB-12)、14(FY23-KB-14)、16(FY23-KB-16)代,以及FY23-KB-14与在KMB-17细胞中适应性生长的第19(FY23-KB-19)、20(FY23-KB-20)、21(FY23-KB-21)代的VP1区序列及毒力变化情况,分析该疫苗株的遗传稳定性。结果与在Vero细胞上分离的原始毒株FY23-V-2相比,在KMB-17细胞中适应性生长的FY23-KB株的原始种子(第12代)、主种子(第14代)和工作种子(第16代)的VP1区序列出现了3个碱基突变,引起2个氨基酸改变,分别为VP1的第226位的Ser突变为Pro和第282位的Asn突变为Asp;与第14代基因序列相比,第19、20、21代的VP1区序列,分别有6、8和11个碱基突变,其中大部分为无意义突变,仅在第21代出现了两个位点(P134和P230)的氨基酸改变;所有代次的病毒滴度均维持在6.5~7.0 lgCCID50/ml。结论 EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)毒种FY23-KB株在KMB-17细胞中连续传代,VP1序列未发生明显变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性,从分子水平证明了该疫苗的安全性。     

Ⅲ型登革病毒在C6/36及Vero细胞中复制对其毒力的影响

目的探讨Ⅲ型登革病毒(dengue virus,DENV)在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响。方法将DV3-1及DV3-2两株Ⅲ型DENV在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种至Vero细胞连续传代培养。用Ⅲ型DENV标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,PCR扩增获得传代毒种全长基因序列,并与原代病毒基因序列进行比对。结果 DV3-1在C6/36细胞上传代至第17代次(P17-C6/36)时毒力保持稳定,DV3-2在盲传过程中均未见明显的细胞病变;将DV3-1和DV3-2第17代次病毒在Vero细胞上继续传代,DV3-1传至第10代次(P10-Vero)CPE为40%,DV3-2传至第4代次CPE达30%。DV3-1在P17-C6/36时具有较高的病毒拷贝数,在P0(原代病毒)及P10-Vero时病毒拷贝数偏低。与P0比较,P17-C6/36及P10-Vero全长碱基共16处发生突变,导致12个氨基酸的非同义突变,其中P0和P10-Vero在第5 826、6 251、7 907位点碱基相同,P17-C6/36相应的氨基酸位点(第1 942、2 084、2 636位点)均发生非同义突变。结论传代细胞更换可对Ⅲ型DENV的毒力造成影响,多次传代及更换细胞传代后仍可能发生回复突变。本研究为后续DENV减毒策略的研究提供了实验依据。     

重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中的表达及其细胞毒性

目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5～1.0和1.0～1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。     

吴茱萸碱的体外抗肿瘤活性研究

采用MTT法在不同的时间点检测了不同浓度的吴茱萸碱对S180肉瘤细胞、H22肝癌细胞、人源HepG2肝癌细胞的抑制情况,探讨了吴茱萸碱的体外抗肿瘤活性。结果表明,吴茱萸碱在一定浓度下对S180肉瘤细胞、H22肝癌细胞、人源HepG2肝癌细胞有明显的抑制作用,且随药物浓度的增大,抑制率逐渐增大,与正常组比较作用极其显著。吴茱萸碱作用24h时,对H22肝癌细胞的生长抑制作用较好,IC50值最小(17.49μg·mL-1);作用48h时,对S180肉瘤细胞的抑制作用相对较好,IC50值最小(17.54μg·mL-1);作用72h时,对HepG2肝癌细胞的抑制作用最好,IC50值最小(13.26μg·mL-1)。     

pEGFP-C1-GnRH/TRS在HeLa细胞中的遗传稳定性

目的研究质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS在HeLa细胞中的遗传稳定性。方法取0代及传至第10、20、30和40代的工程细胞,在有选择压力(加G418)的条件下,测定pEGFP-C1-GnRH/TRS质粒丢失率。分别提取各代次工程细胞质粒DNA进行双酶切鉴定。将经酶切鉴定正确的第40代工程细胞质粒测序,并将各代次工程细胞加压筛选后,于荧光显微镜下观察。结果连续传10、20、30和40代后,质粒丢失率均不超过2%。不同代次的工程细胞质粒DNA经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切,酶切图谱相同。第40代质粒的GnRH/TRS序列与原代质粒相同。第40代细胞荧光分析与原代细胞相似。结论质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS在HeLa细胞中有较好的遗传稳定性。     

辅助性T细胞17与相关疾病发生的研究进展

辅助性T细胞17(T helper cells 17,Th17)是新近发现的一种辅助性T细胞,该类细胞在机体的抗微生物免疫中起非常重要的作用,也与很多自身免疫性疾病的发生有一定的关系,如过敏、糖尿病、类风湿性关节炎等。Th17细胞是与Th1及Th2细胞不同的T细胞亚类,可分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等细胞因子。本文就Th17细胞的基本生物学功能、与感染性疾病及自身免疫性疾病发生的相关性作一综述。     

甲型肝炎病毒SYX1株在人二倍体细胞MRC-5上的适应性及遗传稳定性

目的 探讨甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)SYX₁株在人二倍体细胞MRC-5上的适应性及遗传稳定性。方法 将来源于甲肝患者粪便的HAV SYX₁株接种至MRC-5细胞，连续传代至第28代，检测第1～26代病毒的抗原含量和病毒滴度；镜下观察第6代病毒的形态，并检测其理化性质。取第13～15代病毒进行病毒增殖动态研究，确定病毒增殖高峰期。选择第8、12、18、20、22、25、26和28代病毒，提取病毒基因组RNA进行序列测定，分析其遗传稳定性。建立HAV SYX₁株主种子批和工作种子批，按照《中国药典》三部(2020版)要求进行检定。结果 HAV SYX₁株在MRC-5细胞上连续传至8代后，抗原含量稳定在160～320 EU/mL之间，病毒滴度维持在7.3～8.3 lgCCID₅₀/mL；病毒颗粒有空心和实心两种类型，直径为27～32 nm，呈球形，无包膜，表面无突起；可耐受低pH及乙醚。确定病毒增殖高峰期为10 d，抗原含量达160 EU/mL以上，病...     

无血清培养Vero细胞及其传代稳定性分析

目的建立无血清无动物源性培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞的工艺,并分析其传代稳定性。方法采用VP-SFM适应培养Vero细胞,建立无血清无动物源性Vero细胞库,对细胞库进行常规检定;绘制VP-SFM培养Vero细胞的生长曲线;比较140、150、160代Vero细胞在VP-SFM中培养的比生长速率(μ)和分裂次数(Cd);比较142、147、153代Vero细胞在VP-SFM中培养的狂犬病病毒滴度;比较无血清与含血清培养140、150、160代Vero细胞的μ和Cd值;分别在250 ml spinner flask中加入2 g/L cytodexⅠ、在3 L生物反应器中加入3 g/L cytodexⅠ培养Vero细胞,观察细胞贴壁和生长情况。结果建立的无血清无动物源性Vero细胞库,细胞密度为4×10~6个/ml,冻存前细胞活率为100%,复苏后细胞平均活率为(94.20±3.95)%,无菌检查和支原体检查合格;细胞在VP-SFM中复苏传代后生长良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第8天进入平台期,第12天达最大细胞密度20.5×10~5个/ml,并维持至第14天,活细胞数开始下降,最大μ值为0.025 4 h~(-1)。Vero细胞在无血清培养基中传代稳定性较好,140、150、160代Vero细胞在VP-SFM培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05);142、147、153代Vero细胞在VP-SFM培养的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P0.05);140、150、160代Vero细胞在无血清和含血清培养基培养的μ和Cd值差异无统计学意义(P0.05)。在生物反应器微载体系统中,采用无血清培养基培养Vero细胞,细胞贴壁及生长状态良好。结论初步建立无血清、无动物源性物质的Vero细胞库,采用方瓶静置培养或微载体搅拌培养,细胞生长状态均良好,传代稳定性也较好。     

冻存H_(22)细胞在卡介苗抑瘤小鼠模型中的应用

目的探讨冻存H22肝癌细胞应用于卡介苗抑瘤小鼠模型的可行性。方法制备冻存H22细胞,分别将冻存10和83 d的H22细胞复苏,计算细胞存活率;将高(7.5×106个/ml)、中(5.0×106个/ml)、低(2.5×106个/ml)剂量的新复苏的H22细胞与1 mg/ml治疗用卡介苗混合后经左侧背部皮下免疫BALB/c小鼠,0.1 ml/只,对照组只接种相应浓度的H22细胞,接种后30 d,称量小鼠皮下瘤体重量,并计算试验组的抑瘤率,试验重复2次。结果冻存10和83 d的H22细胞复苏后的存活率分别为85.45%和82.25%。所有对照组小鼠接种H22细胞后均有肿瘤形成,成瘤率均为100%;同一次试验中,各试验组瘤体重量均明显小于同剂量对照组(P<0.05);同一次试验中,各试验组间瘤体重量差异无统计学意义(P>0.05);不同次试验中,同剂量对照组间瘤体重量差异均有统计学意义(P<0.05);各试验组的抑瘤率均大于60%。结论冻存H22细胞可满足抑瘤试验需要,但试验稳定性仍需改进。     

一种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法的建立

目的 建立基于人白血病T细胞株Jurkat的抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte immunoglobulin,ALG)淋巴细胞毒效价定量检测方法,并进行验证。方法 采用人Jurkat细胞作为靶细胞,抗人T细胞兔免疫球蛋白(商品名：Grafalon)作为待检样品,建立其淋巴细胞毒效价定量检测方法。优化反应体系,考察细胞培养密度、细胞代次对待检样品效价的影响,并对方法的精密度进行验证。结果 优化的反应体系组成为50μL待检样品+50μL补体(1∶5稀释)+50μL细胞(5×10⁶个/mL);细胞传代密度为2×10⁵个/mL传代培养72 h或3×10⁵个/mL传代培养48 h用于效价测定最佳;当细胞生长状态较好且一致时,从P10到P25代次的细胞效价测定结果较一致。采用该方法板内重复测定待检样品效价,变异系数(CV)为6.32%,重复性良好;不同代次Jurkat细胞测定待检样品效价6次,CV为4.15%,中间精密度良好。结论 建立了一种便捷、精确的测定ALG淋巴细胞毒效价的定量检测方法,为...     

洋甘菊总黄酮体外抗肿瘤活性研究

采用CCK-8法研究了洋甘菊总黄酮对人肺癌细胞A549、人胃癌细胞AGS、人宫颈癌细胞HeLa及SiHa、人食管癌细胞Eca-109及TE-1、人肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制作用,并采用流式细胞术检测了洋甘菊总黄酮对SiHa细胞周期分布及凋亡率的影响。结果表明,与正常对照组比较,洋甘菊总黄酮对7种肿瘤细胞增殖均有不同程度的抑制作用,其中对SiHa细胞的抑制作用最强,作用48 h的IC₅₀值为(97.74±4.02)μg·mL^-1;洋甘菊总黄酮低、中剂量组(25μg·mL^-1、50μg·mL^-1)干预SiHa细胞24 h后,细胞阻滞在G₀/G₁期,总凋亡率由5.88%±0.29%分别升至11.57%±0.27%、18.08%±1.63%,说明低剂量洋甘菊总黄酮可抑制SiHa细胞增殖,诱导SiHa细胞凋亡。     

不同细胞对乙型脑炎病毒蚀斑减少中和试验的影响

目的分别使用不同细胞测定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)滴度及乙型脑炎灭活疫苗效价,分析不同细胞对检测结果的影响。方法将JEV P3株接种至长满单层的MDBK、Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的6孔板,采用蚀斑试验测定JEV的PFU;将乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)免疫小鼠,取静脉血,分离血清,经56℃灭能30 min后,与JEV P3株混合,接种至长满单层的Vero、BHK-21、LLC-MK2细胞的6孔板,采用蚀斑减少中和试验检测乙型脑炎灭活疫苗的效价。结果 JEV在4种细胞上均可产生细胞病变(cytopathic effect,CPE),但在MDBK细胞上不形成蚀斑,病毒感染的Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的收获液病毒滴度分别为10.02、9.42和9.21 lg PFU/ml;3种细胞测定乙型脑炎灭活疫苗效价T值VeroLLC-MK2BHK-21,其中Vero细胞与BHK-21和LLC-MK2细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异有统计学意义(P0.05),LLC-MK2与BHK-21细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异无统计学意义(P0.05)。结论 4种细胞感染JEV后均可产生CPE,但MDBK细胞不能形成蚀斑;不同细胞测定疫苗效价,蚀斑减少率及对应T值也不同,其中Vero细胞测定T值最大,BHK-21细胞测定T值最小。     

重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞染色体核型分析

目的分析重组人生长激素Fc融合蛋白工程细胞(rhGH-CHO细胞)染色体核型。方法采用0. 1μg/m L秋水仙碱处理分裂中期的细胞,经固定、染色,制片观察,选取染色体形态及分散度较好的视野拍照。应用Image-ProPlus 6. 0(IPP)软件打开图片,利用手动测量工具(manual measurements)随机测量50个2n=22的CHO-k1和rhGH-CHO细胞中染色体长臂和短臂长度,计算各染色体的相对长度(各染色体与最长染色体长度的比值)及短臂/长臂的比值,并绘制染色体核型的B-Spline特征曲线。结果 rhGH-CHO和CHO-k1细胞的染色体数目均为22条,且染色体核型特征曲线一致。结论 rhGH-CHO细胞来源于CHO-k1细胞,且未受其他细胞污染。     

新疆疏花蔷薇果不同极性部位的体外抗肿瘤活性研究

采用CCK-8法研究了新疆疏花蔷薇果30%乙醇部位(E1)、50%乙醇部位(E2)、70%乙醇部位(E3)、90%乙醇部位(E4)、水部位(E5)对人胃癌细胞MGC-803、人食管癌细胞Eca-109、人肺癌细胞NCI-H1299及A549、小鼠腹水瘤细胞S180、人慢性髓原白血病细胞K562、人组织细胞淋巴瘤细胞U937和人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖的抑制作用。结果表明,与空白对照组相比,疏花蔷薇果不同极性部位对各肿瘤细胞的体外增殖均具有不同程度的抑制作用,其中E1对各肿瘤细胞增殖的抑制作用最明显,对MGC-803细胞的抑制作用尤为显著,IC₅₀值为(19.63±0.36)μg·mL^-1;E3对U937细胞的增殖有一定抑制作用,IC₅₀值为(69.06±1.14)μg·mL^-1;E4对Eca-109细胞的增殖有一定抑制作用,IC₅₀值为(58.06±3.63)μg·mL^-1;E5对K562细胞的增殖有明显的抑制作用,IC₅₀值为(...     

可控流变工艺生产无纺布专用PP树脂

选择合适的基础树脂、降解剂,在国产第二代环管聚丙烯(PP)装置上采用可控流变工艺生产无纺布专用树脂。以熔体流动速率(MFR)为(6±1)g/10 min的PP粉料为基础树脂,采用降解剂B成功生产了MFR达(37±7)g/10 min的无纺布专用PP树脂H30S。产品应用试验表明:H30S等规指数大于96.0%,拉伸弹性模量大于1 200 MPa,性能指标优良,用户使用后反馈良好。     

柯萨奇病毒A组16型G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学

目的探讨柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学。方法常规培养Vero和人二倍体KMB-17细胞,待细胞长至单层,接种G20株病毒,进行病毒蚀斑试验,以0.1 MOI的感染复数分别感染此两种细胞,置不同温度和pH维持液中进行培养,每2 h收样1次至第24 h,以48 h收样作为对照样,微量滴定法检测病毒滴度,并绘制增殖动力学曲线。结果 G20株病毒在Vero及KMB-17细胞中传代适应后,均可导致细胞病变。G20株病毒在此两种细胞中培养,pH 6.0、pH 6.5时,不同培养温度下,病毒基本不增殖;pH 7.5与pH 7.0的病毒增殖基本一致,增殖速度随温度呈现37℃>35℃>33℃的趋势;在33℃～37℃、pH 7.0～8.0时,病毒均有不同程度的增殖;在41℃、各pH条件下,病毒增殖均明显受到限制。结论病毒在此两种细胞中,37℃,pH 7.5培养条件下,增殖速度及滴度均较理想。     

γ-氨基丁酸对Hela细胞端粒酶活性影响的研究

目的探讨γ-氨基丁酸(GABA)对Hela细胞端粒酶活性的影响。方法用不同浓度γ-氨基丁酸作用于体外培养的hela细胞,用自动电泳凝胶成像分析仪进行结果分析。结果1mmol/L的GABA作用48h时,Hela细胞的端粒酶活性降低最显著。结论GABA对Hela细胞端粒酶活性起下调作用,其下调作用可能与其抑制肿瘤细胞增殖、恶化有关。     

人细胞内Ca2+对CD4+T细胞免疫功能调控作用的研究进展

CD4⁺T淋巴细胞是人体免疫系统中重要的免疫细胞之一,主要分为Th1、Th2、Th17、滤泡辅助T细胞(T f ollicular helper cells,Tfh)及调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)。CD4⁺T淋巴细胞功能取决于T细胞受体(T cell receptor,TCR),TCR的激活触发了内质网释放Ca²⁺,Ca²⁺作为细胞的第二信使,通过改变其在细胞内外的浓度来参与细胞周期进展和增殖等多个生物活动过程,以维持免疫细胞的正常功能。CD4⁺T淋巴细胞与脂肪肝、肝脂沉积、肝炎、肿瘤等多种疾病的发生发展有关。因此,本文就细胞内Ca²⁺对CD4⁺T细胞免疫功能调控作用的研究进展作一综述,以期为某些疾病新临床治疗方案的研发提供参考。