复合型阴离子交换层析填料Capto adhere纯化工艺的优化

目的优化复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,并进行验证。方法利用中心复合设计(central composite design,CCD)法对影响复合阴离子交换层析的3个因素(上样液pH值、上样液电导率值、上样量)进行优化,拟合出响应曲面,找出最优参数范围。将优化的Capto adhere层析工艺与亲和层析相结合,纯化CHO细胞表达的IgG1单抗培养液,验证工艺参数的稳定性。结果优化的Capto adhere层析工艺为:上样液pH值6.9,上样液电导值率6.3 mS/cm,上样量300 mg/ml gel;CHO细胞表达的IgG1单抗培养液先经蛋白A亲和层析柱初步纯化,再经优化的Capto adhere层析工艺进一步纯化后,样品纯度达98.9%,蛋白A残留量为0.000 52%,宿主细胞蛋白残留量为0.015%,与预测值比较,结果偏差小于10%,且均符合质控标准,两步层析总收率达86.7%。结论优化了复合型阴离子交换层析填料Capto adhere的纯化工艺,利用亲和层析与Capto adhere复合阴离子交换层析两步法纯化单抗是有效、简便、可行的。     

确定性筛选设计在Purcise Q膜纯化抗体的应用

目的：通过确定性筛选设计（DSD）方法建立单抗的Purcise Q膜阴离子交换工艺,进一步降低残留宿主细胞蛋白（HCP）含量。方法：将亲和层析洗脱过滤液作为样品,进行Purcise Q膜层析,选取上样pH、上样电导、载量、流速、峰收集条件5个因子为输入因子,以回收率、HCP去除率、多聚体含量为输出响应值,使用确定性筛选设计DOE模型进行实验。结果：在实验参数范围内,多聚体含量没有明显的变化,HCP含量显著降低。上样电导和载量显著影响HCP去除率,而载量、流速和峰收集条件则显著影响层析回收率。利用JMP的模拟实验功能获得了稳健工艺参数组合（上样电导3 ms/cm、载量300 g/L、流速25 MV/min、峰收集50 mAU/mm）,进一步利用决策树机器学习方法自动获得设计空间（上样电导3.0～3.6 ms/cm、载量300～460 g/L、流速5～25 MV/min、峰收集50～180 mAU/mm）。结论：确定性筛选设计实验方法适用于膜层析的工艺开发,能够一段式快速获得稳健工艺参数组合和设计空间,对于工艺放大、工艺转移和降低生产风险极具指导意义。     

实验设计在重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺建立过程中的应用

目的 通过实验设计(Design of Experiment,DOE)对重组人生长激素-Fc(recombinant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白纯化工艺中阴离子交换层析的层析条件进行优化,以降低蛋白原液中宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量。方法 利用Minitab 19中DOE功能创建4因子2水平完全析因实验设计,通过DOE对rhGH-Fc纯化工艺中离子交换层析条件(流速、上样量、缓冲液pH、洗脱液盐浓度)进行优化,找出操作空间。结果 建立的DOE模型能准确预测实验结果,其中上样量、缓冲液pH、洗脱盐浓度以及缓冲液pH与洗脱液盐浓度的交互效应对收获液中HCP含量有显著影响。获得的最佳层析条件为：上样量15 mg/mL,流速120 cm/h,洗脱液pH 7.0～8.0,洗脱液盐浓度0.1 mol/L。该层析条件下洗脱液中HCP含量均<400 ng/mg,在确定操作空间的结果范围内满足验证要求。结论 本实验成功应用DOE确定了阴离子交换层析去除HCP的最佳层析条件,为其在生物制药领域的更多应用提供了参考。     

流穿模式离子交换层析去除单抗聚集体

针对基质和配基相同、配基密度和接枝方式不同的两款阳离子交换介质Eshmuno CP-FT和Eshmuno CPX，比较它们在流穿模式下对单抗聚集体的去除能力。首先考察了不同pH和电导率下单抗单体和聚集体的静态吸附性能，发现在低pH和高电导、高pH和低电导条件下均能实现较高的单抗单体纯度和收率，综合性能Eshmuno CP-FT较优。进一步考察了最佳吸附条件下不同保留时间的穿透曲线，若控制单抗单体纯度99%,Eshmuno CPFT介质载量高达556 g/L，单抗单体收率为83.2%；而Eshmuno CPX载量只有269 g/L，收率仅60.4%。此外，Eshmuno CP-FT的产率是Eshmuno CPX的2倍，缓冲液消耗仅为Eshmuno CPX的一半左右。吸附动力学结果表明，Eshmuno CP-FT吸附聚集体速度更快，对单体的顶替作用也更强。对于流穿模式去除单抗聚集体，合理的介质设计很重要，优化配基密度及其空间分布可以调整和平衡单抗单体和聚集体的结合，促进聚集体吸附分离，该结果可为研发新型流穿模式介质提供指导。     

新型层析技术在人乳头瘤病毒L1蛋白病毒样颗粒快速纯化中的应用

目的采用新型层析技术快速纯化人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。方法应用新型的基于阴离子交换和分子筛原理的色谱填料CaptoCore 700初纯昆虫细胞表达的HPV L1蛋白VLPs,再用高流速、高分辨力的阴离子交换树脂Capto Q ImpRes进一步纯化。各步纯化的样品经SDSPAGE进行分析,采用ImageQuant图像分析软件分析两步纯化后蛋白的纯度,并对初纯蛋白进行质谱分析;改良Lowry法测定初纯蛋白的浓度,并计算杂蛋白去除率。结果昆虫细胞表达的HPV L1蛋白经CaptoCore 700初纯后,目标蛋白组成的VLPs存在于流穿组分中,经质谱分析,为目的蛋白HPV L1;料液处理量为1个柱体积时,杂蛋白去除率达80%,料液处理量为2个柱体积时,杂蛋白去除率为76%。初纯的蛋白经Capto Q ImpRes进一步层析纯化,HPV L1蛋白的纯度接近100%。结论 CaptoCore 700加Capto Q ImpRes两步层析纯化能够快速高效地纯化HPV L1蛋白VLPs,整个工艺过程简单、快速、高效、易放大,适用于大规模生产。     

基于离子交换层析技术提取发酵液中的丙酸

用7种不同性能的阴离子交换树脂吸附发酵液中丙酸,考察了发酵液酸化方式及pH值对吸附量的影响,分析了不同浓度H2SO4的解吸情况,比较了多柱串联组合层析提高丙酸收率的可行性. 结果表明,大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂ZGD630对发酵液中的丙酸吸附量最高,采用H型阳离子交换树脂D001酸化工艺,当pH值由6.5降至3时,ZGD630树脂对发酵液中丙酸的静态吸附量从54.34 mg/g提高至110 mg/g,动态吸附量达152.5 mg/g. 用4 mol/L H2SO4进行解吸,丙酸浓度最高达81.8 g/L,为初始发酵液的2.12倍. 采用3柱串联组合层析时丙酸收率达62.15%,较单柱层析显著提高.     

用离子交换层析技术提取发酵液中丙酸

用7种不同性能的阴离子交换树脂吸附发酵液中丙酸,考察了发酵液酸化方式及p H值对吸附量的影响,分析了不同浓度H_2SO_4的解吸情况,比较了多柱串联组合层析提高丙酸收率的可行性.结果表明,大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂ZGD630对发酵液中的丙酸吸附量最高,采用H型阳离子交换树脂D001酸化工艺,当pH值由6.5降至3时,ZGD630树脂对发酵液中丙酸的静态吸附量从54.34 mg/g提高至110 mg/g,动态吸附量达152.5 mg/g.用4 mol/L H_2SO_4进行解吸,丙酸浓度最高达81.8 g/L,为初始发酵液的2.12倍.采用3柱串联组合层析时丙酸收率达62.15%,较单柱层析显著提高.     

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法 rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果 Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95. 40%、95. 90%和99. 19%,宿主蛋白残留量分别为2 500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0. 56和0. 12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24. 5、3. 2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97 300,等电点范围为5. 5~6. 5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。     

重组白喉毒素无毒突变体CRM_(197)柱复性及纯化工艺的优化

目的优化重组白喉毒素无毒突变体CRM197(recombinant cross reacting material 197,rCRM197)柱复性及纯化工艺。方法将Sephacryl S-200凝胶柱复性和Q Sepharose FF强阴离子交换层析结合,复性和纯化rCRM197;通过正交试验L9(34)考察凝胶层析复性时流速、离子交换层析纯化的pH值、淋洗液中NaCl浓度和洗脱液中NaCl浓度4种因素对rCRM197纯度及回收率的影响,筛选rCRM197复性及纯化的最佳工艺。结果包涵体经Sephacryl S-200凝胶柱复性后,相对分子质量小于36 000的杂质已被去除;经Q Sepharose FF离子交换层析后,rCRM197纯度达95%以上;在复性时流速为10 ml/min、离子交换层析纯化的pH值为7.5、淋洗液为50 mmol/L Tris-Cl+30 mmol/L NaCl、洗脱液为50 mmol/L Tris-Cl+50 mmol/L NaCl的条件下,rCRM197能达到纯度和回收率的共平衡。结论已筛选出rCRM197复性及纯化的最佳工艺,该工艺操作简便,制备的rCRM197纯度高,适用于rCRM197的产业化。     

A型肉毒抗毒素的层析纯化

目的层析纯化A型肉毒抗毒素,提高免疫球蛋白F(ab′)2的纯度。方法采用阴离子交换层析纯化A型肉毒抗毒素,并通过试验设计(design of experiment,DoE)方法优化缓冲液的pH与电导。结果流穿液中的小分子杂蛋白含量受电导的影响较显著,并随着电导的降低而降低,而pH在试验设计范围内对其影响较小;聚集体/聚合体含量在低pH、高电导时含量较高,高pH、低电导时含量较低;F(ab′)2的纯度主要受电导的影响,并随着电导的升高而降低,在试验设计范围(2~20 ms/cm)内,F(ab′)2的纯度均在90%以上。结论采用阴离子交换层析可有效降低A型肉毒抗毒素中聚集体/聚合体以及部分小分子杂蛋白的含量,提高F(ab′)2的含量。     

一种可用于大规模单克隆抗体纯化的新型Protein A填料

目的比较不同型号Protein A填料的性能,筛选合适的Protein A填料,用于大规模单克隆抗体(简称单抗)纯化。方法采用表达H02单抗的CHO细胞培养上清,测试不同供应商Protein A填料的蛋白结合载量,选择合适的填料,用于大规模单抗纯化;检测宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)、外源DNA及Protein A残留量,以评价其纯化效果;检测Protein A柱在位清洗(cleaning in place,CIP)效果,并验证其循环使用次数。结果 Amsphere Protein A JWT203填料为合适的ProteinA填料,H02单抗大规模纯化后,可有效去除HCP、DNA及脱落Protein A;采用0.1 mol/L NaOH进行CIP,经过300个循环,对H02单抗仍保持80%以上动态结合载量,Protein A脱落无明显增加,对HCP、外源DNA、聚合体的去除能力无明显改变,层析图谱与初始基本一致,Amsphere Protein A JWT203填料的理化性质较稳定。结论 AmsphereProtein A JWT203是一种可用于大规模单抗纯化的新型Protein A填料。     

鸡白痢沙门氏菌兔抗血清多抗IgG的纯化与稳定

建立了离子交换层析介质一步纯化鸡白痢沙门氏菌兔抗血清获得多抗免疫球蛋白G (IgG)的方法，利用IgG与杂蛋白等电点的差异，指导阴阳离子交换层析介质筛选和操作条件优化；针对多抗IgG易失活的难题，采用差示扫描荧光法为纯化后的IgG筛选稳定剂。结果表明，通过毛细管等电聚焦测得兔抗血清多抗IgG的等电点为6.04?7.08，阳离子交换介质CM Sepharose Fast Flow层析纯化的IgG最高电泳纯度为63.5%，高效液相尺寸排阻色谱测得IgG回收率为15.5%；阴离子交换层析纯化效果更佳，pH 5.5条件下Q Sepharose XL(Q-XL)介质层析获得的IgG最高纯度达99.3%，回收率达67.5%；200 g/L山梨醇对IgG具有最佳稳定作用，IgG的2个热变性温度分别提高了5.52和8.84℃，70℃时山梨醇的稳定作用更明显；以200 g/L山梨醇为稳定剂、用阴离子交换层析介质Q Sepharose XL一步纯化所得IgG具有高纯度、高收率及高稳定性，且制备工艺简单。     

甲型肝炎病毒复合层析介质Capto Core 400的纯化效果

目的 探索新型复合层析介质Capto Core 400层析填料纯化甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的效果。方法用Capto Core 400层析介质纯化人胚肺二倍体细胞(2BS株)培养收获的HAV粗纯液,经流速(60、150、300、450 cm/h)、上样缓冲液pH(6.6、7.0、7.4)、上样缓冲液盐离子浓度(0、0.15、0.3、0.45 mol/L)、载量[0.5、1、2、4柱体积(column volume,CV)]筛选最适纯化HAV的条件,并与传统Sepharose 4FF层析介质纯化效果进行比较。结果 初步确定Capto Core 400纯化工艺条件为流速150 cm/h、上样缓冲液pH 7.0～7.4、盐离子浓度0.15 mol/L、上样量2 CV时,纯化效果最好,病毒回收率平均为92.61%,蛋白去除率平均为84.25%。Sepharose 4FF层析介质纯化HAV抗原回收率平均为76.03%,蛋白去除率平均为73.21%,Capto Core 400层析介质纯化效果优于Sepharose 4FF层析介质。结论Capto Core 400复...     

UV/Fenton-Fe~0技术降解盐酸副品红的研究

采用基于Fe~0的非均相UV/Fenton技术对水中盐酸副品红(BR9)的去除效果和主要影响因素进行了研究。结果表明:当pH=3.0,Fe~025 mg/L,H_2O_2 34 mg/L时,1 min后BR9的去除率达93.4%,反应符合伪一级降解动力学;初始BR9浓度升高,反应速率降低,BR9绝对去除量增加。pH升高,BR9去除率降低,pH3时,BR9去除率70%;水中少量天然有机物(TOC 5~10 mg/L)和常见无机阴离子(Cl~-、SO_4~(2-)和NO_3~-)均抑制了体系对BR9的降解;自由基抑制实验证实降解过程符合羟基自由基(·OH)氧化机理。     

离子交换批量层析纯化重组类人胶原蛋白Ⅱ

对阳离子交换树脂CM52纯化类人胶原蛋白Ⅱ(Hum an-like Collagen B ioprote inⅡ,HCBⅡ)的合适条件进行了研究。通过实验,确定了批量层析的最佳操作条件,即在pH=4.0、NaC l 0.15 mol/L、进料质量浓度7 mg/mL、处理量17.26 mL/g进行吸附,吸附时间为60 m in,然后在pH=4.0、NaC l 0.30 mol/L下进行脱附。实验表明:采用批量层析吸附HCBⅡ后上柱洗脱,树脂CM52对HCBⅡ的吸附量可达到48.6 mg/g,回收率83.8%,最终纯化的HCBⅡ达电泳纯,相对分子质量为97k。     

一种含烷氧基柔性长支链苯并咪唑功能化聚苯醚阴离子交换膜研究

本文合成一种含烷氧基柔性长支链苯并咪唑功能化聚苯醚阴离子交换膜,并进行了相应的表征。制得的阴离子交换膜显示出较高的OH^-传导能力及优越的化学稳定性。PPO-OH-M₄在20℃时电导率为35.4 (m·S)/cm,当温度升高至60℃时,电导率增加到55.7 (m·S)/cm,体现了优越的离子传导率。亲水柔性长支链与疏水主链相互作用,形成了明显的微相分离,构建了连续的离子传输通道。将PPO-OH-M₄浸泡于80℃1 mol/L KOH溶液340 h后,电导率仍保持87.5%。长的烷氧基支链聚集,相互盘绕,有效减弱OH^-对功能基团的进攻,可为合成高性能阴离子交换膜提供了新的思路。     

离子交换法分离S-苄基-g-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

采用离子交换法对酶法合成的S-苄基-g-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)进行了分离纯化. 研究了Q Sephrose FF阴离子交换树脂对S-Bzl-GGC的吸附等温线,很好地符合Sips吸附等温线模型. 考察了pH值、洗脱梯度、流速和进样量等条件对纯化效果的影响,建立了一套基于Q Sephrose FF阴离子交换树脂的纯化方案. 结果表明,在pH 8.2、洗脱梯度0~30% B(Tris-HCl缓冲液+1 mol/L NaCl) 12 mL、流速2 mL/min、进样量500 mL的优化条件下,经一步分离,产物纯度可达98.5%,经1H-NMR鉴定产物结构正确.     

Kitasatospora sp.MY 5-36中e-聚赖氨酸降解酶的纯化及酶学性质

对Kitasatospora sp. MY 5-36中e-聚赖氨酸降解酶(PLD酶)进行了纯化和酶学性质研究. 通过DEAE-Sepharose, Source 15Q, Mono Q三步阴离子交换层析从细胞中得到纯酶，收率达40.7%，纯化倍数为500倍. 经SDS-PAGE电泳、凝胶过滤层析检测PLD酶由2个同聚亚基组成，亚基和全酶相对分子量分别为43.6和87.0 kDa. PLD酶的最适反应温度为30℃，最适pH值为7.0, 20~40℃保存时酶活力稳定，50~60℃保存时酶活力迅速下降，最大反应速率Vmax=0.112 mmol/(L×min), 米氏常数Km=0.216 mmol/L. PLD酶是一种金属酶，能够被Co2+激活、被Ca2+抑制.     

Q Sepharose^TM XL强阴离子交换色谱快速纯化猪心中肌红蛋白和细胞色素C

以Q SepharoseTM XL强阴离子交换色谱结合Sephadex G-75分子排阻色谱快速提取纯化猪心中肌红蛋白（Myoglobin,Mb）和细胞色素C（Cyt C）。在pH值为7.6-8.5范围内,Cyt C吸附在Q SepharoseTMXL强阴离子交换柱上,而Mb会缓慢通过。所以选择QSepharoseTMXL强阴离子交换柱的上样pH值为7.9,洗脱pH值为7.2。电泳检测证明,经过QSepharoseTMXL柱初步纯化所得Mb和Cyt C的产率分别为89.7%和93.2%;再经过Sephadex G-75分子排阻色谱可得到纯的Mb和Cyt C,其产量分别为77.43mg.（kg猪心）-1和86.42mg.（kg猪心）-1。使用QSepha-roseTMXL强阴离子交换色谱能从猪心中快速制备纯的Mb和Cyt C。     

Q SepharoseTM XL强阴离子交换色谱快速纯化猪心中肌红蛋白和细胞色素C

以Q SepharoseTM XL强阴离子交换色谱结合Sephadex G-75分子排阻色谱快速提取纯化猪心中肌红蛋白（Myoglobin,Mb）和细胞色素C（Cyt C）。在pH值为7.6-8.5范围内,Cyt C吸附在Q SepharoseTMXL强阴离子交换柱上,而Mb会缓慢通过。所以选择QSepharoseTMXL强阴离子交换柱的上样pH值为7.9,洗脱pH值为7.2。电泳检测证明,经过QSepharoseTMXL柱初步纯化所得Mb和Cyt C的产率分别为89.7%和93.2%;再经过Sephadex G-75分子排阻色谱可得到纯的Mb和Cyt C,其产量分别为77.43mg.（kg猪心）-1和86.42mg.（kg猪心）-1。使用QSepha-roseTMXL强阴离子交换色谱能从猪心中快速制备纯的Mb和Cyt C。