流感病毒疫苗株在MDCK细胞中增殖条件的优化

目的 优化四价流感裂解疫苗中 H1N1(IVR-180)、H3N2(IVR-186)、BV(.NYMC BX-69A)、BY(B/Phuket/3073/2013)亚型疫苗株在MDCK细胞中的增殖条件.方法 以血凝滴度和半数组织感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID...     

乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)、胰酶终浓度(2. 5、5、7. 5、10、15、20μg/mL)、细胞接毒密度(50×10⁴、100×10⁴、300×10⁴、500×10⁴、700×10⁴个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10^-2、胰酶终浓度为10μg/m L、细胞接毒密度为300×10⁴个/mL、病毒收获时间为72 h。流感病毒在...     

B型流感病毒在MDCK细胞上的遗传稳定性

目的研究流感病毒NYMC BX-51B株在MDCK细胞上连续传代的遗传稳定性。方法将SPF级鸡胚制备的流感病毒NYMC BX-51B尿囊液毒株接种至MDCK细胞上,连续传代培养至10代(M1～M10),参照《中国药典》三部(2015版)毒种检定方法进行支原体和无菌检查、外源因子检查、鉴别试验,并进行血凝试验和病毒滴度检测。提取尿囊液、M1代、M10代病毒总RNA,RT-PCR法扩增血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因,并进行测序。结果流感病毒NYMC BX-51B株在MDCK细胞上连续传代培养至M10代,血凝滴度最高可达1∶256,病毒滴度最高可达6. 5 LgCCID_(50)/mL;鉴别试验、无菌检查、支原体检查、外源因子检查结果均符合药典要求。尿囊液、M1代、M10代病毒的HA和NA基因的氨基酸序列与GenBank中登录的流感病毒NYMC BX-51B的HA和NA基因比对结果完全一致。结论 NYMC BX-51B型流感病毒在MDCK细胞基质上连续传代培养至M10代,遗传稳定性良好,为MDCK细胞基质流感疫苗的研究和生产奠定了基础。     

流感病毒H5N1在Vero细胞上培养条件的优化

目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。     

无血清培养MDCK细胞生产狂犬病病毒条件的初步优化

目的开发一种适应于MDCK细胞生长和狂犬病病毒生产的无血清培养基MDCK-SFM,并对MDCK细胞生产狂犬病病毒的条件进行初步优化。方法方瓶培养MDCK细胞,考察混合脂类、微量元素、氢化可的松、酵母抽提物和鱼胨水解物对MDCK细胞生长的影响。转瓶微载体批培养MDCK细胞,以获得细胞在不同培养基中的生长动力学。以不同的感染量(MOI)和感染时间(TOI)接种狂犬病病毒,确定MDCK细胞感染狂犬病病毒的最佳MOI与TOI。比较含10%NCS的DMEM、VP-SFM和MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒的效果。结果混合脂类有利于细胞贴壁,酵母抽提物和鱼胨水解物可不同程度地促进MDCK细胞生长。以MDCK-SFM培养基培养的MDCK细胞最高密度可达14.3×105个/ml。在MOI=0.5、TOI=72h的条件下,可得到最高的病毒滴度。MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒,可获得较高的病毒滴度(5.13lgFFU/ml)。结论MDCK-SFM培养基适于MDCK细胞生长和培养狂犬病病毒,且成本低,成分比较明确,在MDCK细胞高密度培养生产狂犬病疫苗方面具有较高的应用价值。     

流感病毒在Vero细胞上的适应性

目的研究WHO指定流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上的适应性,为用Vero细胞制备流感疫苗奠定基础。方法优化不同培养基、胰酶浓度、pH值等培养病毒的条件及收毒时间,将流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,并进行血凝效价检测及RT-PCR分析。结果在病毒维持液为F12+DMEM、pH为7.5、胰酶含量为1.5μg/ml、培养3 d收获病毒时,可获得较高的病毒血凝效价,连续传4代,病毒血凝效价降为0,RT-PCR检测结果为阴性。结论WHO推荐的流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,病毒血凝效价逐渐降低。     

低血清培养Vero细胞和流感病毒条件的优化

目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。     

稳定表达胰蛋白酶原的重组MDCK细胞分离流感病毒效果初步分析

目的 初步考察稳定表达胰蛋白酶原的重组MDCK细胞(即MTY6细胞)分离流感病毒的效果。方法 按照世界卫生组织(World Health Organization,WHO)全球流感监测网络和国家流感中心(National Influenza Centers,NICs)推荐的病毒分离方法，使用MDCK和MTY6细胞同步分离包含H1N1、H3N2和B型流感病毒核酸阳性的咽拭子样本共20份，对分离培养液分别使用豚鼠红细胞和鸡血红细胞进行凝集试验，统计比较不同类型红细胞凝集效果，以及不同细胞分离病毒阳性率和血凝素滴度。结果 相同病毒分离物对两种类型红细胞的凝集效果不同，豚鼠红细胞完全凝集时间约为鸡血红细胞2倍，沉积形状呈环状，血凝滴度平均为鸡红细胞的23.6±1.2倍。相同条件下，有3份样本两种细胞均分离阴性，11份样本两种细胞均分离阳性，其余6份样本MDCK细胞分离阴性，而MTY6细胞分离阳性，MTY6细胞分离阳性率较MDCK细胞高30%；分离阳性样本包括H1N1亚型8份，MTY6细胞分离病毒血凝素滴度显著高于MDCK细胞，平均为13.0(1.7,23.0)倍；H3N2亚型和B型各2份，MT...     

生物反应器高密度无血清培养全悬浮MDCK细胞和流感病毒工艺的建立

目的 优化生物反应器高密度无血清培养全悬浮MDCK细胞和流感病毒的条件,并放大培养规模,建立MDCK细胞和4种型别流感病毒的培养工艺。方法 分别在不同溶氧（DO）、pH、转速、接种密度条件下培养MDCK细胞,每24 h取样计数,优化细胞培养条件后,放大至50 L生物反应器,并接种4种型别流感病毒（H1N1:A/California/7/2009、H3N2:A/Texas/20/2012、BV:B/Brisbane/60/2008、BY:B/Phuket/3073/2013）,接毒条件为MOI=10-4,胰酶终浓度为15μg/mL,细胞密度为（1.8～2.2）×106个/mL,病毒维持液为DMEM,培养温度为甲型34.5℃、乙型33.5℃,检测病毒血凝效价、病毒滴度（CCID50）和血凝素（hemagglutinin,HA）含量。结果 在5 L及50 L生物反应器中培养MDCK细胞,活细胞密度均可在72 h后达到8.0×106个/mL,活率在95%以上;H1N1、H3N2、BV、BY的血凝效价分别为7、11、9、9 log2(HAU/25μL),CCID50均达6.5以上,HA含量分别为...     

Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒

目的 采用Vero细胞生物反应器微载体无血清培养甲型流感病毒。方法 将Vero细胞分别采用无血清和有血清培养基于生物反应器(pH 7.2,温度37℃,溶氧量50%,转数60 r/min)中培养24 h,均用无血清培养基进行灌流培养至7 d,进行计数,并按MOI=0.1接种H1N1型流感病毒,加入终浓度为1μg/mL的TPCK-胰酶,于生物反应器(pH 7.8,温度33.0℃,溶氧量25%,转数60 r/min)中培养18、22、42、48、66 h,取样,检测血凝效价。结果 Vero细胞经无血清和有血清培养基培养7 d的细胞数分别为(133.4±2.0)×10⁴和(193.8±1.3)×10⁴个/mL,接种H1N1流感病毒66 h后血凝效价几何平均数分别为1∶388和1∶675,前者细胞数及病毒血凝效价几何平均数均显著低于后者(t分别为7.068和4.332,P均<0.05)。结论 采用Vero细胞通过生物反应器微载体无血清培养H1N1型流感病毒的血凝效价可满足流感病毒裂解疫苗制备的要求。     

无血清悬浮MDCK细胞培养流感病毒纯化工艺的初步建立

目的 建立无血清悬浮MDCK细胞培养流感病毒的下游纯化工艺.方法 采用40 L反应器,收获无血清悬浮MDCK细胞培养的流感病毒,经澄清浓缩后,添加不同终浓度(1、10、30、50 U/mL)的Benzonase(R)核酸酶,置37℃酶解不同时间(2、4、6、8h),优化核酸酶去除细胞残留DNA的条件.采用两步层析法,探...     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。     

Vero细胞无血清培养基的筛选及其培养流感病毒H5N1条件的优化

目的筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件。方法取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELL~(TM) VERO、Virus Pro ~(TM) VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI。结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:p H 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68μg/ml,MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍。结论筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1 Vero细胞适应株无血清培养的条件。     

儿茶提取物体外抗甲型流感病毒的实验研究

分析儿茶提取物体外抗甲型流感病毒(IAV)的活性。实验分3组,水提物处理组、IAV对照组和细胞对照组,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和细胞荧光素酶活性检测法检测儿茶水溶性提取物抗甲型流感病毒活性。CCK-8法证实,儿茶水提物对甲型流感病毒有较好的抗病毒作用。细胞荧光素酶相对强度分析显示,在4～12 g/L浓度范围内,儿茶水提物处理组细胞的相对荧光强度比对照组明显降低(P 0. 05)。儿茶水提物体外对甲型流感病毒的活性及感染性有较强的抑制作用。     

流感病毒裂解工艺的优化

目的探讨影响流感病毒裂解的因素,优化流感病毒裂解工艺。方法分别在不同裂解时间(Triton X-100裂解1、2、3和4 h)、不同终浓度的裂解剂(终浓度为0.5%、0.6%、0.7%和0.8%的Triton X-100)、不同总蛋白浓度(2 000、3 000和4 000μg/ml)及不同的离子强度[终浓度为0.01、0.05、0.1和0.5 mol/L的PBS(p H 7.2)]下,对流感病毒进行裂解,电镜下观察病毒裂解效果,同时采用免疫单扩散法检测血凝素含量,Lowry法检测总蛋白含量,计算蛋白含量/血凝素含量比值(裂解后病毒纯度)及血凝素回收率,确定最佳裂解工艺参数。结果当裂解前病毒纯化液蛋白含量范围为2 000~3 000μg/ml,PBS终浓度为0.1 mol/L时,利用终浓度为0.7%~0.8%的Triton X-100裂解流感病毒2 h,可获得最佳裂解效果。结论确定了流感病毒最佳裂解参数,优化了流感病毒裂解疫苗生产中的裂解工艺。     

流感病毒超滤工艺的优化

目的分析截留相对分子质量不同的超滤膜浓缩对流感病毒纯化效果的影响,以获得杂质含量低的高浓度病毒液。方法将H1N1、H3N2、Bv和By 4个型别流感病毒分别接种9~11日龄鸡胚,经(34±1)℃培养72 h后,收获尿囊液,经连续流离心获得澄清的病毒液后,再进行截留相对分子质量1 000 000、300 000的超滤膜及其两种超滤膜组合的超滤浓缩,测定超滤前后的总蛋白含量、卵清蛋白含量和血凝滴度。结果截留相对分子质量1 000 000的超滤膜超滤后,杂质去除率高,均在80%以上,截留相对分子质量300 000的超滤膜超滤后杂质去除率相对低,但后者病毒回收率较高,二者组合既能降低杂蛋白含量,又可提高病毒回收率。结论流感病毒鸡胚尿囊液采用截留相对分子质量1 000 000+300 000超滤膜组合超滤浓缩,病毒纯化效果较好。     

甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的稳定性

目的考察甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的稳定性,以保证临床用药质量。方法将3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗分别于37℃和2~8℃放置不同时间,进行鉴别试验、外观、装量、pH、血凝素含量、硫柳汞含量、无菌检查、异常毒性检查、细菌内毒素含量、卵清蛋白含量等全项目检测,观察疫苗的热稳定性和长期稳定性。结果 3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗于37℃放置7 d,各项指标均符合甲型H1N1流感病毒裂解疫苗制造和检定规程要求,且与0 d结果比较无明显差异;3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗于2~8℃放置18个月,各项指标均达到合格要求。结论甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的热稳定性及长期稳定性均良好,表明甲型H1N1流感病毒裂解疫苗质量稳定。     

分泌抗甲型流感病毒内部抗原单克隆抗体细胞株的建立

由于甲型流感病毒血凝素具有高度变异性，故其抗血凝素单抗不适于甲型流感病毒感染的病原学诊断。我们应用甲型流感病毒内部抗原D91-11免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS－1融合，获得3林稳定分泌抗甲型流感病毒内部抗原的单克隆抗体细胞株1A9、1B1和1D4，阳性率为     

甲型流感病毒抗原检测试剂盒质控参考品的研制

目的研制甲型流感病毒抗原检测试剂盒质控参考品。方法收集甲型流感病毒阳性样本、乙型流感病毒阳性样本和非流感病毒样本,采用流感病毒抗原检测试剂盒方法对样本进行验证。通过协同标定参考品,确定最低检出限范围,3家单位进行适用性检测。反复冻融观察其稳定性。结果所用的16株病毒经3家单位联合检测,特异性良好,均为甲型流感病毒,检测结果符合率为100%;反复冻融5次后,稳定性良好。结论建立了第1套甲型流感病毒抗原检测试剂盒质控参考品及相应的质量标准。