甲型副伤寒沙门菌抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及初步应用

目的建立甲型副伤寒沙门菌抗体间接ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。方法以甲型副伤寒沙门菌体脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为包被抗原,HRP标记的羊抗小鼠IgG作为二抗,TMB作为显色剂,建立检测甲型副伤寒沙门菌抗体的间接ELISA法,优化间接ELISA法的试验条件,并进行验证。取2批甲型副伤寒结合物原液,分别经NIH小鼠大腿内侧皮下各免疫3次,间隔14 d,第2、3次免疫后7 d采血,按建立的间接ELISA法检测血清中甲型副伤寒沙门菌抗体水平,计算抗体阳转率。结果抗原的最适包被浓度为2μg/ml,血清最适稀释倍数为1∶80,酶标二抗的最适稀释比例为1∶6 000;包被抗原与血清的最适反应时间为2 h,血清与酶标二抗的最适反应时间为1 h,封闭液室温下最适封闭时间为2 h。用建立的方法检测20只小鼠甲型副伤寒沙门菌全菌体超免血清,血清稀释500倍阳性检出率仍不低于80%;检测小鼠甲型副伤寒沙门菌全菌体超免血清的试验内和试验间变异系数分别为4.6%和7.5%,检测阴性血清样品的试验内和试验间变异系数分别为9.4%和13.9%,均低于15%;检测小鼠甲型副伤寒沙门菌全菌体超免血清和甲型副伤寒结合物原液免疫阳性血清的结果为阳性,检测乙型副伤寒结合物小鼠免疫阳性血清、伤寒Vi多糖结合物小鼠免疫阳性血清及阴性血清的结果为阴性。两批甲型副伤寒结合物原液免疫小鼠在第2针免疫后7 d的血清阳转率均为10%,第3针免疫后7 d的血清阳转率均为100%。结论建立的检测甲型副伤寒沙门菌抗体的间接ELISA法灵敏度较高,精密性良好,特异性较强,可用于评价甲型副伤寒结合疫苗的免疫原性。     

甲型副伤寒细菌单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备甲型副伤寒特异性多糖(O-specific polysaccharide,O-SP)单克隆抗体,建立鉴定甲型副伤寒沙门血清型细菌的全菌体ELISA和O-SP的竞争ELISA定量检测方法。方法用甲型副伤寒全菌体免疫小鼠,通过常规方法融合,以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)为载体偶联的O-SP为筛选检测抗原,间接ELISA法筛选分泌抗甲型副伤寒O-SP的特异性抗体杂交瘤细胞株;分别以甲型和乙型副伤寒的O-SP-TT及伤寒Vi-TT为包被抗原,检测制备的单克隆抗体与不同血清型细菌多糖的交叉反应;以不同沙门菌菌体为包被抗原,用制备的1株甲型副伤寒O-SP特异性单克隆抗体进行菌体间接ELISA,检测细菌血清型;用该株单克隆抗体为竞争抗体,建立定量检测样品中O-SP的竞争ELISA方法。结果筛选出6株分泌抗甲型副伤寒O-SP抗体的杂交瘤阳性细胞株;其中2株仅与甲型副伤寒O-SP呈特异性反应,其余4株与乙型副伤寒O-SP呈交叉反应;用其中1株单克隆抗体进行的菌体间接ELISA显示,该株单克隆抗体仅与甲型副伤寒沙门菌反应,而不与伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和肠炎沙门菌反应;竞争ELISA定量检测O-SP的检测范围在0.4~0.003 2μg/ml最准确。结论制备的特异性抗甲型副伤寒O-SP的单克隆抗体可用于甲型副伤寒细菌血清型快速鉴定和O-SP的竞争ELISA定量检测。     

局印发《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》等6个技术指导原则

10月14日，国家食品药品监督管理局以国食药监注[zoos]493号文印发了“关于印发《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》等6个技术指导原则的通知”。通知称，为规范疫苗研发行为，指导疫苗研究单位科学地开展研究工作，根据《药品管理法》、《药品管理法实施条例》及《药品注册管理办法》，国家食品药品监督管理局组织制定了《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》、《生物制品生产工艺过程变更管理技术指导原则》、《联合疫苗临床前和临床研究技术指导原则》、《多肽疫苗生产及质控技术指导原则》、《结合疫苗质量控制和临床研究技术指导原则》和《预防用疫苗临床试验不良反应分级标准指导原则》等6个技术指导原则，现印发，并请转发辖区内各有关单位。     

甲型肝炎灭活疫苗(L-A-1减毒株)的制备及其免疫原性

目的用甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)L-A-1减毒株制备甲型肝炎灭活疫苗,并检测其免疫原性。方法用细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞(2BS株),感染L-A-1减毒株增殖病毒,收获含病毒的细胞,经裂解、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)6000沉淀、三氯甲烷抽提、凝胶过滤层析纯化后,甲醛灭活,氢氧化铝佐剂吸附,制备3批试验疫苗。按照《中国药典》三部(2010版)中甲肝灭活疫苗标准进行各项检定,并进行小鼠效力试验,计算半数有效稀释倍数;将疫苗于37℃存放5、10、15、20、25和30 d,考察疫苗的加速稳定性。结果甲型肝炎病毒经提取纯化后,抗原回收率达80%以上,杂蛋白去除率达95%以上;制备的3批试验疫苗各项检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;小鼠效力试验结果显示,半数有效稀释倍数分别为进口疫苗和国产疫苗的1.25~1.40和2.02~2.26倍;37℃保存30 d,疫苗的体外相对效力仍在合格范围内。结论制备了纯度较高的甲型肝炎灭活疫苗,其在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步规模化生产甲型肝炎灭活疫苗奠定了基础。     

甲型副伤寒杆菌鞭毛抗原酶联免疫方法的建立及初步应用

目的　采用甲型副伤寒杆菌鞭毛抗原单克隆抗体 ,建立检测甲型副伤寒杆菌鞭毛抗原ELISA双抗体夹心法。方法　采用纯化的甲型副伤寒杆菌鞭毛抗原 ,制备 3株鞭毛抗原单克隆抗体细胞 (2C8、2E6和 5D7)。应用免疫印迹试验、交叉反应试验及表位分析进行特异性鉴定。结果　 3株单抗细胞与甲型副伤寒杆菌鞭毛抗原及甲型副伤寒杆菌发生免疫反应 ,与伤寒、乙、丙型副伤寒杆菌及部分沙门氏菌、大肠杆菌无交叉反应。选用其中 2株单抗细胞建立了ELISA双抗体夹心法。检测 163份献血员和 65份发热待查患者血清标本均为阴性 ,15份血培养阳性的甲型副伤寒患者血清标本有 14份为阳性。结论　可直接用单克隆抗体进行检测 ,具有简便、快速等特点     

重组人白细胞介素-1受体拮抗剂质量控制研究

目的建立重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)的质控方法和标准。方法采用黑色素瘤A375.S2细胞杀伤中和试验测定rhIL-1ra的生物学活性,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,用胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的质控方法对rhIL-1ra原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论建立的质控方法和标准可保证产品安全有效,可用于rhIL-1ra的检定。     

疫苗用氢氧化铝佐剂质量标准的初步建立

目的建立疫苗用氢氧化铝佐剂的质量标准。方法参照《欧洲药典》8. 0和《中国药典》四部(2015版),选择5个实验室对6个厂家12批氢氧化铝佐剂样品同时进行17个理化项目的检测及分析,建立适合国内氢氧化铝佐剂的质量标准。结果初步建立了疫苗用氢氧化铝佐剂17项质量标准。经5个实验室检测,12批样品外观、溶解性能、鉴别试验、无菌、吸附率、硫酸盐含量、硝酸盐含量、铵盐含量、砷盐含量、铁盐含量、重金属含量、氯化钠含量、氯化物含量及细菌内毒素的结果均符合《欧洲药典》8. 0和《中国药典》四部(2015版)相关质量标准;而p H值、铝含量、沉降率检测结果不同厂家之间差异较大。结论建立了适合国内氢氧化铝佐剂的质量评价体系,为氢氧化铝佐剂的质量标准进入2015版《中国药典》增补版提供了方法细则和标准制定依据。     

流感疫苗株H3N2(NYMCX-223A)主要抗原基因特征与传代稳定性

目的分析2013年流感疫苗生产用甲型H3N2(NYMCX-223A)毒株主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因特征,并检测该疫苗株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液的传代稳定性。方法对制备的H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液进行全面的生物学特性检测;采用RT-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析;应用MEGA 5.05软件对7株不同年份的H3N2亚型疫苗株的HA氨基酸序列进行比对,绘制基因种系发生树。结果 H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批抗原性与2013年度WHO推荐毒株相一致,其他生物学特性均符合《中国药典》三部(2010版)标准;主要抗原HA基因序列长度为1 701 bp,编码566个氨基酸;NA基因序列长度为1 410 bp,编码469个氨基酸,各代次流感病毒HA和NA基因核苷酸和氨基酸序列均一致,与GenBank公布的序列完全一致,同源性为100%。2013年与2012年H3N2疫苗株HA氨基酸序列相比,同源性为97.5%。2013年与2012年H3N2疫苗株具有较远的进化距离,与同源性结果相对应。结论 2013年甲型H3N2(NYMCX-223A)流感疫苗株主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合《中国药典》三部(2010版)要求。2013年与2012年H3N2疫苗株序列差异较大。     

冻干甲型肝炎减毒活疫苗原液制备中两种抽提方法效果的比较

目的比较冻干甲型肝炎减毒活疫苗原液制备中两种抽提方法的效果,为生产工艺的优化提供参考。方法取超声后甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)收获物,分别以抽提方法 A和B进行抽提纯化,并对制备的疫苗原液进行无菌检查、支原体检查及蛋白含量、病毒滴度检测。以优化的抽提方法连续制备3批试验疫苗原液及成品,并参考《中国药典》三部(2010版)及企业内控监测指标相关要求进行全面检定。结果与抽提方法 A相比,抽提方法 B制备的原液蛋白含量明显降低,且差异有统计学意义(P0.001),而病毒滴度差异无统计学意义(P0.05)。以抽提方法 B连续制备的3批原液、成品的各项检测指标均符合相关要求。结论以抽提方法 B进行疫苗生产,提高了原液的纯度及疫苗质量。     

甲型副伤寒多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及安全性和免疫原性

目的制备甲型副伤寒多糖-破伤风类毒素结合疫苗,并检测其安全性与免疫原性。方法副甲O-SP溶液加入CDAP活化,己二酰肼(ADH)衍化,在碳二亚胺(EDAC)作用下与破伤风类毒素(TT)偶联,反应物经柱层析纯化,制得多糖蛋白结合物,经质量检测后,进行安全性及免疫原性试验。结果所制备的结合物多糖蛋白比稳定在0.6~0.8之间,CL-4B检测Kd≤0.2时的回收率大于75%,高相对分子质量结合物含量不低于90%。免疫双扩散试验显示结合物与副甲家兔超免血清和TT抗血清均产生可见沉淀线。动物安全试验均合格。结合物免疫小鼠后,其血清副甲LPS抗体滴度显著增长,阳转率达到100%。结论用CDAP活化多糖制备的甲型副伤寒-破伤风类毒素结合疫苗质量稳定,安全可靠,且具有良好的免疫原性。     

甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,并对其进行鉴定及初步应用。方法用甲醛灭活的甲型副伤寒沙门菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选出稳定分泌甲型副伤寒沙门菌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对克隆纯化后的阳性细胞扩大培养后,免疫BALB/c小鼠,收获腹水,间接ELISA法检测抗体效价,并进行Ig类和亚类鉴定;腹水经辛酸-硫酸铵盐析法纯化后,采用间接ELISA法、玻片凝集试验、SDSPAGE法、免疫扩散试验进行检测。将纯化后的2株单克隆抗体用于双抗体夹心ELISA法的建立,并用自制配对抗体检测甲型副伤寒患者血浆、乙型副伤寒患者血浆、伤寒患者血浆和正常人血浆。结果共筛选出2株持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H4和2A9,腹水抗体效价为1∶10~7和1∶10~6,分别为IgG_1和Ig G_3亚类,轻链均为κ型。纯化后的单克隆抗体1H4、2A9效价分别为1∶10~7和1∶10~3,1H4纯度大于85%,2A9纯度小于60%。2株单克隆抗体与甲型副伤寒沙门菌50503、50973可产生凝集反应,与伤寒沙门菌50096不产生反应;1H4在稀释度为1∶8时可与甲型副伤寒沙门菌菌体特异多糖(organism specific polysaccharide,OSP)产生凝集反应,而2A9在每个稀释度与OSP均不发生反应。将1H4和2A9用于双抗体夹心ELISA检测法建立,确定1H4/HRP-2A9的组合为最佳配对,用该配对抗体检测阳性样本检出率为100%,正常人血浆样本检出率为0。结论获得2株甲型副伤寒沙门菌菌体抗原单克隆抗体,可用于甲型副伤寒沙门菌的快速鉴定。     

聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗的研制

目的研制安全有效的不含人血白蛋白稳定剂的风疹减毒活疫苗。方法将风疹减毒活疫苗毒种RA27/3株按适当比例接种单层人二倍体细胞MRC-5株,使用无血清、无蛋白的CDM培养基培养病毒,收获病毒液,加入聚乙烯吡咯烷酮作为病毒稳定剂,制备疫苗原液,加入冻干保护剂,制备5批冻干疫苗,进行各项检定。另取1批原液样品,分别加入聚乙烯吡咯烷酮和人血白蛋白作为病毒稳定剂,制成疫苗,进行各项检测。结果5批疫苗各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。同1批原液制备的聚乙烯吡咯烷酮与人血白蛋白稳定剂疫苗的病毒滴度和热稳定性无明显差异。37℃放置6周,两种稳定剂疫苗的病毒滴度均为3.63LgCCID50/ml。结论聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗质量符合《中国药典》三部(2005版)的要求。     

小鼠神经生长因子基因治疗型DNA质粒的质量控制

目的对小鼠神经生长因子(NGF)基因治疗型DNA质粒进行质量控制。方法用酶切鉴定法和PCR法进行DNA质粒的结构确认,鸡胚背根神经节法和免疫印迹测定DNA质粒表达产物的生物学活性,分光光度法测定浓度,琼脂糖凝胶电泳法和DNA-NPR-HPLC法测定纯度,气相色谱法测定乙醇和异丙醇残留量,琼脂糖凝胶电泳法测定RNA残留量,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用上述方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所采用的质控方法和质量标准能够保证该DNA质粒的安全、有效,可用于治疗型DNA质粒的质控。     

重组人尿激酶原质控方法和质量标准的研究

目的建立重组人尿激酶原的质控方法和质量标准。方法以纤维蛋白平板法测定重组人尿激酶原的生物学活性,S-2444发色底物法测定单双链比例,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和分子筛色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于重组人尿激酶原产品的常规检定。     

重组葡激酶-水蛭素融合蛋白质控方法和质量标准的建立

目的建立注射用重组葡激酶(staphylokinase,SAK)-水蛭素(hirudin,HV)融合蛋白(SFH)的质控方法和质量标准。方法采用纤维蛋白平板溶圈(fibrin agarose plate assay,FAPA)法测定SFH的溶栓比活性,纤维蛋白凝块溶解法测定SFH的抗凝比活性;还原型SDS-PAGE测定SFH的相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定SFH的纯度;胰酶裂解后采用RP-HPLC法分析SFH的肽图;其他各项指标的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行。结果用建立的方法对SFH原液和成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求。结论建立的质控方法和质量标准能够保证产品安全、有效、质量可控,可用于注射用SFH产品的常规检定。     

甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的稳定性

目的考察甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的稳定性,以保证临床用药质量。方法将3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗分别于37℃和2~8℃放置不同时间,进行鉴别试验、外观、装量、pH、血凝素含量、硫柳汞含量、无菌检查、异常毒性检查、细菌内毒素含量、卵清蛋白含量等全项目检测,观察疫苗的热稳定性和长期稳定性。结果 3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗于37℃放置7 d,各项指标均符合甲型H1N1流感病毒裂解疫苗制造和检定规程要求,且与0 d结果比较无明显差异;3批甲型H1N1流感病毒裂解疫苗于2~8℃放置18个月,各项指标均达到合格要求。结论甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的热稳定性及长期稳定性均良好,表明甲型H1N1流感病毒裂解疫苗质量稳定。     

国内甲型副伤寒沙门菌疫苗株的16S rRNA基因序列分析

目的对我国4株用于或拟用于疫苗生产的甲型副伤寒沙门菌的16S rRNA基因进行序列分析,考察其保守性和差异。方法提取4株菌基因组DNA,以16S rDNA通用引物进行PCR扩增,并对产物进行克隆及测序。结果4株菌均可扩增出约1500bp的目的基因片段,测序结果表明,4株菌中16S rDNA核苷酸序列一致性达99.77%。结论选择保守性高的16S rDNA区段进行序列测定,以防止种子批的变异,便于对疫苗生产用种子进行质量控制。     

不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及稳定性

目的观察不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及其稳定性。方法配制12批不含硫柳汞的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞),观察其免疫原性及在4、22和37℃保存不同时间的稳定性。结果该疫苗各项检测指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求,实验组与对照组的效价测定结果差异无显著意义。10μg/ml疫苗22℃放置6个月和4℃放置12个月效力均未下降;20μg/ml疫苗在37℃放置4周后,效力略有下降。结论为婴幼儿提供了一种更加安全有效的重组乙型肝炎疫苗。     

国产水痘减毒活疫苗的稳定性观察

目的观察国产水痘减毒活疫苗的稳定性。方法取40批上海生物制品研究所有限责任公司(以下简称上海公司)2007~2013年生产的水痘减毒活疫苗,按照国家食品药品监督管理局批准的水痘减毒活疫苗注册标准和《中国药典》的要求进行各项检定:在0月进行热稳定性试验;在0和18月进行鉴别试验、物理检查、水分检测、无菌检查、异常毒性检查、牛血清白蛋白残留量检测、抗生素残留量检测(2010年10月以后生产的疫苗);在0、6、12、18月进行病毒滴定。结果上海公司2007~2013年生产的水痘减毒活疫苗在有效期内各项指标检定结果均符合水痘减毒活疫苗注册标准和《中国药典》的相关要求。结论上海公司生产的水痘减毒活疫苗质量稳定,安全有效。     

气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量

目的目的采用气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量,并对该方法进行验证及初步应用。方法采用气相色谱法定量测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中的乙醚含量,顶空条件:平衡温度为90℃,平衡时间为30 min。色谱条件:色谱柱:HP-FFAP毛细管色谱柱(25 m×0.32 mm×0.5μm);载气:氮气;流量:1.0~2.0 ml/min;进样口温度:160℃;检测器温度:250℃;柱温:45℃;分流比:5∶1;进样体积:1 ml。对建立的方法进行验证及初步应用,并建立质量标准。结果该方法检测乙醚残留量溶剂对所测组分无干扰;系统适应性良好;乙醚浓度在11~110μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好(r=0.999 3);最低定量限为0.028μg/ml;检测对照品溶液的相对标准偏差(RSD)为2.98%;加标回收率在83.08%~87.58%之间。应用该方法检测9批疫苗样品中的乙醚残留量在0.000 03%~0.000 55%之间,符合《中国药典》二部(2005版)附录ⅧP应不高于0.5%的要求。将乙醚残留量作为该疫苗半成品的质量标准检测项目,限度定为0.05%。结论气相色谱法测定甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚的残留量系统适用性、线性、精密性和准确性良好,且易于操作,简便快速,可用于甲型H1N1流感病毒裂解疫苗中乙醚残留量的测定。