冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的观察冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下的稳定性。方法将冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗放置在2~8℃条件下,定期取样,检查其物理外观,检测多糖含量、水分含量和分子大小,并进行鉴别试验以及异常毒性和免疫原性试验,考察其稳定性。结果冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗于2~8℃保存30个月,各项质量控制指标仍符合该疫苗企业注册标准。结论冻干A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在2~8℃条件下,其质量稳定。     

A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性

目的　观察A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性。方法　疫苗放不同温度和不同时间后 ,用乙醇沉淀法测定A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的游离多糖含量 ,SepharoseCL 4B凝胶层析法测定分子大小。结果液体疫苗放置 2～ 8℃ 9个月 ,游离多糖含量为 30 %以上 ;4℃放置 18个月 ,Kd <0 2的多糖回收率 <6 0 %。冻干疫苗放置 2 5℃和 37℃ 12个月 ,或放置 2～ 8℃ 18个月 ,游离多糖含量均不高于 2 5 % ,Kd <0 2的多糖回收率 >6 0 %。结论　冻干A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗具有良好的稳定性。     

A群脑膜炎球菌多糖-白喉毒素无毒变异体CRM197结合物的制备及其初步评价

目的制备A群膜炎球菌多糖(Group A meningococcal polysaccharide,GAMP)-白喉毒素无毒变异体CRM197(Cross-reactive material 197)结合物,并分析其理化性质及免疫学特性。方法白喉棒状杆菌C7 M1菌株经发酵培养表达CRM197,表达产物经DEAE-4FF层析柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。用溴化氰(CNBr)活化GAMP,己二酰肼(ADH)为连接剂,在碳二亚胺(EDAC)催化下将GAMP与CRM197共价结合,制备GAMP-ADH-CRM197结合物,经Sepharose 4FF层析柱纯化后,进行各项生化检测,采用免疫双扩散检测结合物的抗原性,将结合物皮下注射ICR小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP的抗体滴度,分析其免疫原性。结果发酵培养20 h时,菌液上清中的CRM197蛋白表达量最高;CRM197以分泌形式表达,纯化后纯度达95%以上,可与白喉类毒素单抗发生特异性反应;GAMP-ADH-CRM197结合物各项生化指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求,与A群流脑诊断血清形成明显的沉淀线,结合物诱生的多糖特异性抗体滴度显著高于多糖组和混合物组。结论成功制备了GAMP-ADH-CRM197结合物,其具有良好的抗原性和免疫原性,为以CRM197为蛋白载体制备脑膜炎球菌结合疫苗奠定了基础。     

以白喉毒素无毒变异体蛋白CRM197和破伤风类毒素为载体的Y群脑膜炎球菌多糖结合物对小鼠的免疫原性

目的探讨以天然白喉毒素无毒变异体蛋白CRM197和破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)为载体的Y群脑膜炎球菌多糖(group Y meningococcal polysaccharide,MenYPS)结合蛋白对小鼠的免疫原性。方法将MenYPS用1,6-己二酰肼(1,6-adipic acid dihydrazide,ADH)进行衍生,制备MenYps-ADH衍生物,将MenYPS-ADH衍生物在碳二亚胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDAC]的作用下,分别与CRM197和TT共价结合,制备3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物,采用琼脂双扩散法检测结合物中多糖抗原的血清型特异性。经BALB/c小鼠大腿内侧皮下注射制备的衍生物及结合物,2.5μg/只,0、14、28 d各免疫1次,分别于第7、21和35天经小鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清GMT。参考《中国生物制品规程》(2000版)进行无菌试验及异常毒性试验。结果制备的3批MenYPS-CRM197和MenYPS-TT结合物可与MenYPS诊断血清产生沉淀线。MenYPSTT和MenYPS-CRM197免疫小鼠3次后,均产生较高的滴度,MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2、3次免疫小鼠后产生的GMT均明显高于MenYPS-ADH衍生物,差异有统计学意义(P均0.05),而两种结合物GMT差异无统计学意义(P均0.05);MenYPS-TT和MenYPS-CRM197结合物第2次免疫后产生的GMT均明显高于第1次免疫后,第3次免疫后明显高于第2次免疫后,差异均有统计学意义(P均0.01)。无菌试验符合《中国生物制品规程》(2000版)相关要求;异常毒性试验中,豚鼠和小鼠观察7 d后,均无异常反应,体重增加,无死亡。结论 MenYPS与CRM197和TT的结合物均能诱导BALB/c小鼠产生较高的抗体水平,且产生了免疫记忆。     

A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的研制A+C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗。方法A群和C群脑膜炎球菌多糖在溴化氰(CNBr)的活化下,以1,6己二酰肼(ADH)作为连接子,与精制破伤风类毒素(TT)在碳二亚胺(EDAC)作用下结合,再按一定的比例将两者混合,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液,加保护剂冻干后,制成A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果经检定,A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗各项指标均达到了质控标准。该疫苗安全性及免疫原性良好。结论已成功研制出冻干A+C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,该制备工艺是可行的。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备

目的制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,并对其进行生化检测及免疫原性和抗原性分析。方法经溴化氰(CNBr)分别活化的A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖,在己二酰肼(ADH)的连接作用和碳二亚胺(EDAC)的偶联作用下,与破伤风类毒素(Tetanic toxoid,TT)形成结合物。以不同剂量的GAMP-TT和GCMP-TT的混合物免疫小鼠,检测小鼠血清中GAMP、GCMP和TT的抗体滴度,评价其免疫效果。根据剂量试验结果,制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗并进行抗原性检测,并与市售同类产品进行对比试验。结果制备的3批GAMP-AH和3批GCMP-AH的批间差异较小,GAMP-AH和GCMP-AH的衍生率相差较大,由GCMP-AH制备的GCMP-TT的结合率明显高于GAMP-TT(P<0.01),结合物含量差异无统计学意义(P>0.05)。GAMP-TT和GCMP-TT具有良好的免疫原性和抗原性,多糖蛋白结合物组较多糖组可诱导产生更高水平的GAMP和GCMP抗体,且具有免疫记忆。由以上两者制备的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗生化指标、血清抗体效价与市售的同类产品差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功研制了具有良好免疫原性和抗原性的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,为其产业化奠定了基础。     

C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗制备工艺的优化

目的优化C群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)结合疫苗的制备工艺。方法分别采用衍化的降解多糖与TT结合、衍化TT与降解多糖结合和1-氰基-4-二甲基氨基吡啶.四氟化硼(CDAP)活化降解多糖后衍化再与TT结合的方法制备C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物PSAH-TT、PS-AHTT和PSCDAPAH-TT,并进行生化指标和抗原性检测,与溴化氰(CNBr)活化多糖衍化与TT的结合物PSCNBrAH-TT进行免疫原性比较,确定最适制备工艺,并制备2批结合疫苗,与市售疫苗进行免疫原性比较。结果 3种方法制备的多糖蛋白结合物生化指标存在差异,以PSCDAPAH-TT收率最高,且均保持了多糖的抗原性及免疫原性,并有免疫加强效应;PSCDAPAH-TT免疫2针后抗体GMT水平高于PSAH-TT和PS-AHTT,差异有统计学意义(P<0.05),3针后抗体GMT水平仍高于PSAH-TT和PS-AHTT,但差异无统计学意义(P>0.05),PSCDAPAH-TT免疫2针和3针后抗体GMT水平均高于PSCNBrAH-TT,且2针后差异有统计学意义(P<0.05),3针后差异也无统计学意义(P>0.05),但制备的2批PSCDAPAH-TT疫苗免疫2针和3针后的抗体GMT水平均明显高于市售疫苗,差异有统计学意义(P<0.05)。结论经CDAP活化降解多糖后衍化再与载体蛋白结合制备的疫苗具有较好的免疫原性。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫效果

目的观察A群C群脑膜炎球菌结合疫苗对6~23月龄、24~35月龄婴幼儿的免疫原性和免疫持久性。方法选择广西壮族自治区崇左市400名婴幼儿,其中6~23月龄和24~35月龄两个年龄段各200名,分别接种A群C群脑膜炎球菌结合疫苗2剂和1剂。分别于免疫前、全程免疫后1个月、1年采血,血清体外杀菌试验(serum bactericidal assay,SBA)检测血清抗体水平,评价其免疫原性和免疫持久性。结果免后1个月和1年,两个年龄组婴幼儿A群、C群抗体阳性率和GMT均较免疫前显著提高(P均0.001);免后1年,两个年龄组婴幼儿A群、C群抗体GMT低于免后1个月,但仍高于免前;免后1个月和1年,24~35月龄组婴幼儿A群、C群抗体GMT和增长倍数均但,仍高于免前高于6~23月龄组;两个年龄组龄婴幼儿易感者和非易感者A群、C群抗体阳性率和GMT均显著提高。结论 A群C群脑膜炎球菌结合疫苗对6~35月龄婴幼儿具有良好的免疫原性和免疫持久性。     

冻干ACYW 135群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性

目的评价冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的稳定性。方法取3批冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗,分别置2~8℃及37℃存放,于不同时间点(37℃第1、2、3、4、12、24、48周;2~8℃第3、6、12、18、24、30、36个月)取样,上XK16/100 Sepharose CL-4B层析柱后,采用火箭电泳法检测4种多糖分子大小(KD值)及多糖回收率。另取3批疫苗,置2~8℃存放,分别于第12、18、24、30个月取样,进行疫苗全面检定;取同批疫苗进行酸(调p H值至5.0和4.0)、碱(调p H值至10.0和12.0)处理后置2~8℃,于不同时间点取样,上XK16/100 Sepharose CL-4B层析柱后,采用火箭电泳法检测多糖KD值及回收率。结果于2~8℃存放36个月、37℃存放24周的疫苗的多糖KD值及回收率,以及2~8℃存放30个月的疫苗的鉴别试验、外观、水分、多糖含量、分子大小及回收率、无菌检查、异常毒性检查、热源试验、细菌内毒素检查结果均符合企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造和检定规程》(草案)要求。疫苗调p H值至5.0及10.0后置2~8℃存放48 h,多糖KD值及回收率均符合本企业内部《ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗制造检定规程》(草案)要求。结论冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗于2~8℃存放30个月,性能稳定。     

A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制

目的 制备安全有效的Ａ群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。方法 通过碳二亚胺（ＥＤＡＣ）将Ａ群脑膜 炎球菌多糖－ＡＨ衍生物与破伤风类毒素（ＴＴ）蛋白共价结合,制备Ａ群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。结果 所结合 成的多糖－蛋白结合物,具有Ａ群脑膜炎球菌多糖和破伤风类毒素抗原特异性。单独用多糖免疫小鼠未能诱导出 高水平的血清Ｐｓ抗体,而用结合物免疫小鼠却诱导出高水平的血清Ｐｓ抗体及ＴＴ抗体,并有免疫记忆性。结论 为进一步临床评价该疫苗的人群免疫效果提供了实验基础。     

VVM标签在A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗上的应用

目的探讨VVM标签在A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(以下简称流脑AC结合疫苗)上的应用效果,为该疫苗的冷链运输管理提供参考。方法抽取2012年生产的3批批签发合格的流脑AC结合疫苗,贴上VVM14标签,分别于37℃放置0、7、14、21 d和25℃放置0、30、60、90、100 d取样,检测VVM14标签反应区和参照区的A值差值及疫苗的多糖含量、p H值、水分、游离多糖含量、游离蛋白含量和鼠免疫原性等质量指标。结果随着放置时间的延长,流脑AC结合疫苗VVM14 A值的差值明显下降,游离多糖含量均有升高趋势,鼠免疫原性均有下降趋势,但变化不明显,其余指标变化趋势不明显,均在《A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗制造及检定规程》YBS00102009质量标准规定的范围内。疫苗于37℃放置21 d和25℃放置100 d后,质量均符合标准要求。结论冻干流脑AC结合疫苗具有良好的热稳定性,VVM14的A值差值与疫苗质量具有相关性,VVM14标签在疫苗上的应用,可直观反映该疫苗在冷链运输、保存和使用环节的质量,提高免疫接种率。     

用于ACYW 135群脑膜炎球菌多糖-CRM 197结合物分子量检测的SEC-RI-MALS联用方法的建立及验证

目的建立分子筛层析(size exclusion chromatography,SEC)-示差检测(refractive index,RI)-多角度激光光散射(multi-angle laser light scattering,MALS)联用方法检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物的分子量,并对方法进行验证。方法首先单机测定ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中各血清群多糖-CRM97结合物的dn/dc值(折射率增量),再采用SEC-RI-MALS联用技术,以0.9%Na Cl为流动相,TSKgel G5000PWxl为色谱柱,在流速0.4 ml/min的条件下,对结合物的分子量进行测定。对方法的重复性和日间精密性进行验证,并通过对样品进行高温或冻融处理,分析SEC-RI-MALS法在监测分子量变化上的应用。结果各血清群多糖-CRM197结合物的高、中、低浓度样品平行测定3次重均分子量的相对标准偏差(RSD)均小于10%,不同浓度下测定的分子量大小无显著差异,其分子量分布曲线重合性好;连续5日检测各血清群多糖-CRM197结合物分子量的RSD值均小于10%,其分子量分布曲线重合性好。经沸水浴处理,各血清群多糖-CRM197结合物的分子量分布情况均发生了明显的变化;冻融处理对A、C群多糖-CRM197结合物的分子量无太明显的影响,W135和Y群多糖-CRM197结合物在冻融过程中出现了一定的分子聚集现象。结论建立的SEC-RI-MALS联用测定多糖-CRM197结合物分子量的方法具有良好的重复性和日间精密性,能够用于ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中结合物分子量的检测,并可对结合物在不同保存条件下的稳定性进行监测。     

A、C群流脑多糖结合疫苗与A群流脑多糖疫苗序贯加强免疫效果观察

目的观察A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(MCV-AC)和A群流脑多糖疫苗(MPV-A)序贯加强免疫效果。方法对118名2岁内已完成2剂次MPV-A或MCV-AC基础免疫接种的儿童,3~4岁时进行1剂次MCV-AC加强免疫。采集免疫前后血清标本,分别测定A、C群杀菌抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT),计算阳转率。根据既往流脑疫苗基础免疫接种史,分两个观察组(MCV-AC和MPV-A)进行分析。结果加强免疫前,MCV-AC和MPV-A组A群抗体阳性率(18.75%和14.28%)和GMT(2.09和1.79)差异均无统计学意义(P0.05);两组间C群抗体阳性率(均为0)差异无统计学意义(P0.05),GMT(1.30和1.00)差异有统计学意义(P0.05)。加强免疫后,MCV-AC和MPV-A组A群抗体阳性率(97.91%和100.00%)和GMT(241.63和227.32)差异均无统计学意义(P0.05),同组间加强免疫前后抗体阳性率和GMT差异均有统计学意义(P0.05);两组间C群抗体阳性率(89.58%和92.85%)差异无统计学意义(P0.05),GMT(106.09和105.00)差异有统计学意义(P0.05),同组间加强免疫前后抗体阳性率和GMT差异均有统计学意义(P0.05)。结论 A、C群流脑结合疫苗有必要进行加强免疫,其加强免疫效果不受基础免疫疫苗种类的影响,均能产生有效的免疫应答。     

A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性及免疫持久性观察

目的观察A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在不同年龄段的免疫原性及免疫持久性。方法选择广西南宁市隆安县4岁以内健康易感婴幼儿1 190名,分为3~8月龄(试验组220名,对照组133名)、1~2岁(试验组202名,对照组212名)、3~4岁(试验组218名,对照组205名)3个年龄段,试验组经上臂外侧三角肌附着处肌肉注射A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗,对照组经上臂外侧三角肌附着处皮下注射A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗。3~8月龄组共免疫3针次,1~2岁组共免疫2针次,均间隔1个月;3~4岁组免疫1针次。各组免疫剂量均为0.5 ml/次。3~8月龄组分别于免疫前和第2针免疫后4周、第3针免疫后4周及末次免疫后3年采血,1~2岁组分别于免疫前、第2针免疫后4周及末次免疫后3年采血,3~4岁组分别于免疫前、免疫后4周及免疫后3年采血,采用杀菌力试验及ELISA法检测血清抗体水平,观察疫苗的免疫效果及抗体随时间变化情况。结果不同年龄段婴幼儿免疫A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗后,抗体水平均显著提高,且在免疫后3年仍保持较高的抗体保护水平。结论A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗针对不同年龄段均保持很高的免疫保护水平。     

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗游离蛋白含量HPLC检测方法的建立

目的 建立A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量的HPLC检测方法,并对其进行验证。方法 采用HPLC法,色谱条件:色谱柱:TSKgel G3000SW(300 mm×7.5 mm,10μm);流动相:0.01 mol/L磷酸盐缓冲液[pH(7.2±0.2)];流速:0.5 ml/min,自动进样100μl;检测波长:280 nm;柱温:室温。对该方法进行专属性、分离度、线性、精密性和准确性验证,确定该方法的定量限和检测限;应用建立的方法检测3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品中游离蛋白含量。结果 该方法检测游离蛋白的专属性、分离度良好;蛋白对照品在3~18μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R~2=0.998;3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品的加样回收率在82.9%~119.33%之间,RSD小于5%;确定方法检测限为1.0μg/ml,定量限为2.6μg/ml。3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液和A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品未检测出游离蛋白。结论 建立的HPLC法简便、灵敏、准确度高,可检测A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量。     

C群脑膜炎球菌结合疫苗的工艺稳定性及其免疫原性

目的研究C群脑膜炎球菌荚膜多糖(Group C meningococcal polysaccharide,GCMP)与破伤风类毒素(Tetanustoxoid,TT)结合疫苗的工艺稳定性及其免疫原性。方法以己二酸二酰肼(ADH)作为间隔剂,碳二亚胺(EDAC)为缩合剂,扩大量制备8批GCMP-TT结合物,以生化、免疫学方法分析8批GCMP-AH衍生物和GCMP-TT结合物的主要特性;将8批GCMP-TT结合物分别免疫NIH小鼠,ELISA法检测小鼠血清中特异性抗GCMP和抗TT的IgG抗体,分析其免疫原性。结果 8批GCMP-AH衍生物及GCMP-TT结合物各项生化检测指标基本一致,批间差异较小,均达到《欧洲药典》的规程(7.0版)要求,并具有良好的抗原性。免疫小鼠的血清中均产生了较高水平的抗GCMP和抗TT的特异性IgG抗体,与GCMP产生的特异性IgG抗体相比,差异有统计学意义(P0.001);GCMP-TT结合疫苗第2针、第3针与第1针相比,免疫后产生的IgG抗体水平差异均有统计学意义(P0.001)。结论 GCMP-TT结合疫苗的制备工艺稳定、可靠,具有良好的免疫原性,并可诱导免疫记忆,为脑膜炎球菌结合疫苗的规模化生产提供了重要的实验依据。     

A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗免疫学效果观察

目的观察A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌(Meningococcal group A&C/Haemophilus influenzae type b,ACHib)多糖结合疫苗的免疫原性。方法采用开放、完全随机、盲态观察的方法,将1 800名观察对象分为临床试验组和对照组,每组各900名,两组又按3个年龄段分为3～5、6～11和12～71月龄组。试验组仅经上臂三角肌肌内注射试验疫苗(ACHib多糖结合疫苗),对照组分别经左右上臂同时注射两种对照疫苗(A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗和Hib结合疫苗)。3～5月龄组免疫3针,每针间隔1个月;6～11月龄组免疫2针,每针间隔1个月;12～71月龄组免疫1针。分别于免疫前、全程免疫后30～35 d采集静脉血,分离血清,采用功能性抗体杀菌力法检测A、C群脑膜炎球菌血清杀菌抗体滴度,间接ELISA法检测Hib抗体水平,并计算抗体阳转率及抗体增长倍数。结果免疫后,3个年龄段的试验组与对照组血清A、C群脑膜炎球抗体和Hib抗体阳转率差异均无统计学意义(P>0.05)。3个年龄段试验组与对照组易感和非易感人群A、C群脑膜炎球菌抗体滴度差异均无统计学意义(P均>0.05),而试验组Hib抗体水平低于对照组,且差异有统计学意义(P<0.001)。结论 ACHib多糖结合疫苗具有良好的免疫原性,可作为上述3种病原菌的预防制剂推广使用。