重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD的构建及其对胃癌细胞的杀伤作用

目的构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,并探讨其对胃癌细胞的杀伤作用及可能的机制。方法利用同源重组的方法在痘苗病毒VG9的TK区插入锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)基因,构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,经筛选及纯化后,测定病毒滴度。将重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD及痘苗病毒VG9分别按不同的MOI(0.01、0.1、1、10)及转染时间(12、24、36、48 h)转染至人胃癌细胞株7901,MTT法检测病毒对胃癌细胞的杀伤作用。按MOI=1将重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD及VG9分别转染人胃癌细胞株7901 48 h,同时以PBS作为对照,Western blot法检测胃癌细胞中Mn SOD的表达,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡情况。结果经筛选及纯化后,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD滴度为2×108 pfu/m L。MOI为1和10时,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD对胃癌细胞的杀伤作用明显优于VG9(P0.05);转染24和36 h,重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD对胃癌细胞的杀伤效果明显强于VG9(P0.05)。转染后,Mn SOD蛋白可在胃癌细胞中呈高表达,且VG9-Mn SOD组胃癌细胞的凋亡率明显高于VG9组及对照组(P0.05)。结论成功构建了重组溶瘤痘苗病毒VG9-Mn SOD,其对胃癌细胞具有明显的杀伤作用,该作用可能是通过促进胃癌细胞凋亡产生的。     

骨形态发生蛋白9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移的抑制作用

目的探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移的抑制作用及其可能的机制。方法将人乳腺癌MDA-MB-231细胞分为试验组(感染BMP9腺病毒)、空白对照组(未感染)及GFP对照组(感染GFP腺病毒),RT-PCR法检测各组细胞中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)基因mRNA的转录水平,Western blot法分别检测各组细胞中BMP9及OPG蛋白的表达水平。将BALB/c裸鼠分为空白对照组(注射空白对照细胞)、GFP对照组(注射GFP对照组细胞)及试验组(注射试验组细胞),每组5只,均经胫骨贴骨注射,1×106个/(0.3μl·只),X片成像技术分析各组裸鼠溶骨区域变化,免疫组化法检测各组裸鼠瘤体组织中OPG蛋白的表达。结果试验组MDA-MB-231细胞中OPG基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显高于空白对照组和GFP对照组(P0.05),仅试验组细胞中有BMP9的表达。试验组裸鼠胫骨瘤体直径及溶骨区域均明显小于GFP对照组和空白对照组(P0.05),试验组裸鼠瘤体组织中OPG的表达量明显高于GFP对照组(P0.05)。结论BMP9可抑制MDA-MB-231细胞溶骨性骨转移,可能是通过上调OPG/RANKL/RANK系统中OPG的表达而发挥作用。本实验为探讨BMP9在肿瘤骨转移微环境中的作用机制奠定了基础。     

纳米氧化铈对人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的探讨纳米氧化铈(nm-Ce O2)对人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法建立人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为阴性对照组(等体积双蒸水)、阳性药组[九州虫草2 000 mg/(kg·次)]、nm-Ce O2高、中、低剂量组[300、100、33.33 mg/(kg·次)],共5组,各组荷瘤裸鼠均经口灌胃给药,每天1次,共17 d,观察各组裸鼠移植瘤生长情况,计算肿瘤体积(VT)、肿瘤生长抑制率,称量肿瘤重量,观察移植瘤组织病理变化,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal dexynucleotidyl transferase mediated d UTP nick end la beling,TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。结果与阴性对照组比较,nm-Ce O2各剂量组均具有抑制人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠皮下移植瘤生长的作用,并能促进瘤细胞的变性、坏死和凋亡(P<0.05)。nm-Ce O2高剂量组的肿瘤生长抑制作用低于阳性药组(P<0.05),但nm-Ce O2高、中剂量组促进肿瘤细胞凋亡的作用高于阳性药组(P<0.05)。结论 nm-Ce O2对人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠皮下移植瘤具有显著的生长抑制作用。     

抗瘤酮A_(10)、5Fu、GM-CSF和IL-2的抗癌效果

目的　比较A1 0 、5Fu、GM CSF和IL 2的抗癌效果。方法　选取NIH小鼠 ,分别腹腔接种肝腹水HeP A 2 2细胞、骨肉瘤S180细胞及胃癌MFC细胞 ,10d后将注射每种细胞的小鼠分为 3组 ,每组 12只 ,分别于小鼠腹腔注射A1 0 、5Fu、GM CSF和IL 2 ,每日 1次 ,每次 1ml 只 ,连续给药 8d后改为每 3d给药 1次 ,观察小鼠生存时间及抑瘤效果。结果　A1 0 、5Fu、GM CSF及IL 2均能延长小鼠生存时间 ,A1 0 抑制肝HeP A 2 2肿瘤效果显著。结论　A1 0 、5Fu、GM CSF和IL 2均有抑制癌细胞生长作用     

慢病毒介导的人乳头瘤病毒16型E6基因shRNA对荷瘤裸鼠宫颈癌生长的抑制作用

目的探讨慢病毒介导的人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16型E6基因shRNA在体内对荷瘤裸鼠宫颈癌生长的抑制作用。方法将BALB/c-nu裸鼠随机分为空白对照组、干扰组和无义干扰组,经皮下接种宫颈癌Caski细胞(2×106个),移植瘤直径达0.5 cm时,空白对照组于瘤体局部注射PBS,干扰组和无义干扰组分别于瘤体局部注射靶向HPV16型E6基因的shRNA-PLL3.7干扰慢病毒和无义干扰慢病毒(3×108TU/ml),2周后检测瘤体大小和重量的变化,采用免疫组化法检测肿瘤组织中HPV16型E6、P53和P21蛋白的表达。结果与无义干扰组和空白对照组比较,干扰组裸鼠体内肿瘤明显缩小,瘤体重量明显降低(P<0.000 1),无义干扰组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);干扰组肿瘤组织中HPV16型E6蛋白的表达被抑制,P53和P21蛋白的表达水平明显升高。结论慢病毒介导的HPV16型E6基因shRNA能有效抑制动物体内宫颈癌的生长,具有潜在的开发应用前景。     

环磷酰胺暴露后Piwil2在人神经母细胞瘤移植瘤中的表达

目的探讨环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)暴露后Piwil2在人神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)移植瘤中的表达。方法建立免疫活性C57BL/6j系小鼠的人NB SK-N-SH细胞株荷瘤模型,选择瘤体积在100~200 mm3之间的20只荷瘤小鼠,随机分为生理盐水对照组(NS组)和环磷酰胺组(CP组),每组10只,CP组每日经腹腔注射CP75 mg/kg,2次/周,连续2周;NS组每日经腹腔注射NS 2 ml。每2天测量肿瘤体积,计算相对肿瘤体积(RTV);停药后次日处死小鼠,称瘤重,计算抑瘤率(IR);并采用RT-PCR法检测各组移植瘤组织中Piwil2基因m RNA的转录水平,免疫组化法和Western blot法检测各组移植瘤组织中Piwil2蛋白的分布及表达水平。结果与NS组比较,CP组移植瘤的RTV和瘤重均显著降低(P0.05),CP组的平均抑瘤率为83.56%。两组移植瘤组织中Piwil2基因m RNA的转录水平差异无统计学意义(P0.05)。NS组移植瘤组织中Piwil2蛋白高表达于胞浆,而CP组大部分肿瘤细胞坏死,Piwil2蛋白表达下降,细胞核稀疏,核浓缩,细胞体积变小;CP组移植瘤组织中Piwil2蛋白的表达水平明显低于NS组(P0.05)。结论 CP干预后,移植瘤缩小,移植瘤组织中Piwil2基因m RNA的转录水平不变,但蛋白表达水平有改变,可能影响人NB抵抗性。     

人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(OH2)生物学特性的稳定性

目的分析人用重组溶瘤单纯疱疹病毒Ⅱ型(oncolytic herpes simplex virus type 2,OH2)生物学特性的稳定性。方法将OH2在Vero细胞中连续传20代,测定不同时间点收获的不同代次(P4、P10、P20)病毒的滴度,并绘制病毒的生长曲线;ELISA夹心法检测表达的h GM-CSF的含量;TF-1细胞培养法检测表达的h GM-CSF的活性;CCK-8试剂盒检测OH2的体外癌细胞杀伤能力。结果 OH2在Vero细胞中连续传20代后,不同代次病毒(P4、P10、P20)的生长曲线模式、表达的h GM-CSF含量及活性、体外癌细胞的杀伤能力均无明显差异。结论 OH2生物学特性的稳定性良好,具有新生物药开发前景。     

人参多糖对鼻咽癌细胞CNE-2裸鼠移植瘤的放疗增敏作用及其可能的机制

目的探讨人参多糖(ginseng polysaccharide,GPS)对人鼻咽癌细胞CNE-2裸鼠移植瘤的放疗增敏作用及可能的机制。方法取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞,经裸鼠背部皮下注射,1×107个/(0.2 ml·只),待瘤体最大径为4~6 mm时,取20只模型裸鼠,随机分为4组:对照组(经腹腔注射生理盐水)、放疗组(每次每只裸鼠经肿瘤局部给予5 Gy X射线照射,每3 d照射1次,共3次)、GPS组(经腹腔注射GPS,30 mg/kg,每次0.3 ml,每72 h给药1次,共5次)和GPS联合放疗组(经腹腔注射GPS,30 mg/kg,每次0.3 ml,每72 h给药1次,共5次;末次给药48 h后开始放疗,每只每次经肿瘤局部给予5 Gy X射线照射,每3 d照射1次,共3次)。开始给药3周后处死裸鼠,取瘤体,称重,测量肿瘤的长、短径,计算肿瘤体积及抑制率;HE染色观察移植瘤组织病理学改变;Real-time PCR检测移植瘤组织中β-catenin基因mRNA的转录水平;免疫组织化学和Western blot法检测移植瘤组织中β-catenin蛋白的表达水平。结果与对照组相比,GPS组、放疗组和GPS联合放疗组的肿瘤体积及瘤重均明显下降(P0.05),抑制率分别为29.87%、52.60%和74.68%;镜下观察可见,GPS联合放疗组细胞凋亡明显,多数细胞核完全溶解,细胞结构消失,坏死的肿瘤组织呈现均质红染表现;GPS联合放疗组移植瘤中β-catenin mRNA及蛋白的表达水平均显著下降(P均0.05)。结论 GPS可抑制CNE-2细胞在裸鼠体内的生长,且对鼻咽癌的放疗具有增敏作用,其机制可能与抑制β-catenin的表达有关。     

冻存H_(22)细胞在卡介苗抑瘤小鼠模型中的应用

目的探讨冻存H22肝癌细胞应用于卡介苗抑瘤小鼠模型的可行性。方法制备冻存H22细胞,分别将冻存10和83 d的H22细胞复苏,计算细胞存活率;将高(7.5×106个/ml)、中(5.0×106个/ml)、低(2.5×106个/ml)剂量的新复苏的H22细胞与1 mg/ml治疗用卡介苗混合后经左侧背部皮下免疫BALB/c小鼠,0.1 ml/只,对照组只接种相应浓度的H22细胞,接种后30 d,称量小鼠皮下瘤体重量,并计算试验组的抑瘤率,试验重复2次。结果冻存10和83 d的H22细胞复苏后的存活率分别为85.45%和82.25%。所有对照组小鼠接种H22细胞后均有肿瘤形成,成瘤率均为100%;同一次试验中,各试验组瘤体重量均明显小于同剂量对照组(P<0.05);同一次试验中,各试验组间瘤体重量差异无统计学意义(P>0.05);不同次试验中,同剂量对照组间瘤体重量差异均有统计学意义(P<0.05);各试验组的抑瘤率均大于60%。结论冻存H22细胞可满足抑瘤试验需要,但试验稳定性仍需改进。     

蛇床子素对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗作用的影响及作用机制

目的探讨蛇床子素(osthole)对鼻咽癌裸鼠移植瘤放疗作用的影响及其可能的机制。方法将鼻咽癌CNE2细胞株经NU/NU裸鼠右腋皮下接种,2×10~8个/只,待移植瘤长至150mm~3时,随机分为对照组(隔1 d经腹腔注射无菌生理盐水,0.2 m L/只)、单纯蛇床子素组[隔1 d经腹腔注射,1.5μg/(g·10μL)]、单纯放疗组(5 Gy/次,隔3 d X射线照射1次)、蛇床子素联合放疗组(经腹腔注射蛇床子素2 h后进行放射治疗,剂量与方法同单纯蛇床子素组及单纯放射组)。每3 d测量移植瘤体积,首次给药后第21天取出移植瘤,称瘤重;流式细胞术检测移植瘤细胞凋亡率;荧光定量PCR及Western blot法分别检测移植瘤细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因m RNA转录和蛋白表达水平。结果与对照组比较,单纯蛇床子素组、单纯放疗组及蛇床子素联合放射组裸鼠移植瘤体积及瘤重均明显下降(P0.05),细胞凋亡率明显升高(P0.05),其中蛇床子素联合放射组最显著,且该组裸鼠移植瘤中VEGF及HIF-1α基因m RNA转录及蛋白表达水平明显低于单纯蛇床子素组及单纯放疗组(P0.05)。结论蛇床子素可增强鼻咽癌裸鼠移植瘤对放疗的敏感性,其机制可能与下调VEGF及HIF-1α表达,抑制血管生成有关。